細胞周期調節因子在乳腺導管增生性疾病及乳腺癌中的表達及意義

武彤彤吳春蓮羅京華黃卓雅楊清緒

（1 惠州市中心人民醫院病理科，廣東 惠州 516001；2 惠州市中醫醫院藥劑科，廣東 惠州 516001）

細胞周期調節因子在乳腺導管增生性疾病及乳腺癌中的表達及意義

武彤彤1吳春蓮1羅京華2黃卓雅1楊清緒1

（1 惠州市中心人民醫院病理科，廣東 惠州 516001；2 惠州市中醫醫院藥劑科，廣東 惠州 516001）

目的 研究共濟失調毛細血管擴張癥突變蛋白（Ataxia-Telangiectasa mutated protein，ATM protein）、檢測點激酶2（Checkpoints kinase1，Chk2）及P53在乳腺浸潤性導管癌（invasive ductal carcinoma，IDC）、導管內癌（ductal carcinoma in situ，DCIS）、非典型導管增生（atypical ductal hyperplasia，ADH）、癌旁正常乳腺組織（normal brease tissues adjacent to cancer，NBTAC）中的表達情況，探討其在乳腺癌發生發展中的作用。方法 采用免疫組化S-P法檢測 63例乳腺浸潤性導管癌、39例導管內癌、42例非典型導管增生、56例癌旁正常乳腺組織中ATM、Chk2及P53的表達情況。結果 ATM、Chk2在乳腺浸潤性導管癌中的表達明顯低于癌旁正常乳腺組織；P53在乳腺浸潤性導管癌中的表達明顯高于癌旁正常乳腺組織；ATM、Chk2與P53表達呈顯著負相關。結論 乳腺浸潤性癌ATM、Chk2表達缺失及P53的表達增高可能是乳腺癌發生、發展的重要因素之一，聯合檢測對早期乳腺癌的診斷及判斷乳腺癌預后有指導意義。

乳腺癌；共濟失調毛細血管擴張癥突變蛋白（ATM）；檢測點激酶2（Chk2）；P53；免疫組織化學

乳腺癌是常見的婦科腫瘤之一，嚴重威脅著婦女的健康。研究表明癌癥的發生是多因素共同作用的結果，其中基因突變占有重要地位。本研究將應用免疫組織化學方法檢測毛細血管擴張性共濟失調癥突變蛋白（ATM）、細胞周期檢查點激酶2（Chk2）及P53在乳腺浸潤性癌、導管內癌、非典型導管增生、癌旁正常乳腺組織中的表達情況，它們在乳腺癌中的作用及相互之間的關系探討其在乳腺癌發生、發展中的作用。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

選取我院病理科2006～2010年的乳腺癌患者（均經病理證實為乳腺浸潤性導管癌）的乳腺活檢組織石蠟包埋標本63例，同時選取我院2006～2010年確診的導管內癌39例，非典型導管增生42例，癌旁正常組織56例。

1.2 實驗方法

采取免疫組織化學試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司），一抗包括鼠源ATM單克隆抗體（美國Zymed公司），兔源Chk2、P53多克隆抗體（美國Zymed公司）。按試劑盒說明書進行操作。免疫組化結果：ATM、Chk2與P53陽性染色定位于細胞核，均為出現黃色到棕褐色顆粒。陽性細胞（10個高倍視野）≤25%計1分，26%～75%計2分，≥76%計3分；陽性細胞的著色強度按無著色、黃色、棕黃色和棕褐色分別判為0、1、2、3分。根據兩項積分之和判斷結果，0分為陰性（-），1—2分為弱陽性（+），3-4分為中度陽性（++），5-6分為強陽性（+++）。+視為低表達，++、+++視為高表達。

1.3 統計學分析

運用SPSS（10.0 for window）軟件進行統計學處理。采用χ2檢驗、非參數Spearman等級相關檢驗。

2 結 果

2.1 ATM、Chk2及P53的表達情況在乳腺浸潤性導管癌（IDC）、導管內癌（DCIS）、非典型導管增生（ADH）、癌旁正常組織（NBTAL）中表達及陽性率（表1）。ATM（圖1）、Chk2及P53（圖2）陽性信號呈黃色到棕黃色顆粒狀。

表1 ATM、Chk2與P53蛋白表達情況

2.2 ATM、Chk2及P53表達結果 ⑴ATM、Chk2蛋白的表達結果。在浸潤性導管癌的陽性率分別為57.1%、55.6%，明顯低于癌旁正常組織76.7%、73.2%，兩種之間存在顯著差異（P＜0.05）；在浸潤性導管癌的陽性率分別為57.1%、55.6%，在導管內癌的陽性率分別為61.5%、58.9%，在非典型導管增生的陽性率分別為61.9%、59.5%，浸潤性導管癌與導管內癌之間，浸潤性導管癌與非低典型導管增生之間均是差異無統計學意義（P＞0.05）。⑵P53蛋白的表達結果 在乳腺浸潤性導管癌的陽性率為49.2%，在導管內癌的陽性率為28.2%，在非典型導管增生的陽性率為30.9%，在癌旁正常乳腺組織中陽性率為10.7%；在浸潤性導管癌與癌旁正常組織之間、浸潤性導管癌與導管內癌之間、導管內癌與癌旁正常組織之間、非典型導管增生與癌旁正常組織之間均存在顯著差異（P＜0.05）。⑶在乳腺浸潤性導管癌、導管內癌中的P53與ATM、Chk2表達之間存在顯著負相關。

圖1 ATM在癌旁正常乳腺組織中導管上皮陽性表達（SP法，×100）

圖2 P53在浸潤性導管癌中癌組織陽性表達（SP法，×100）

3 討 論

共濟失調毛細血管擴張癥突變蛋白（Ataxia-Telangiectasia mutated protein，ATM protein），為一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，含有3056個氨基酸殘基，是一種大分子量蛋白，相對分子質量約為370×103[1]。ATM蛋白激酶是一種自動磷酸化蛋白，分布于細胞核和細胞質內，以細胞核為主，在高等真核生物體組織細胞內普遍存在，一些組織細胞如睪丸、脾臟、胸腺等組織內高表達。通常情況下，ATM蛋白激酶以無活性的二聚體形式存在。

ATM蛋白激酶在維護整個基因組的穩定性中充當重要的角色。應對DNA損傷物，ATM激活不同的效應底物，發揮細胞周期調控、DNA修復和細胞凋亡等作用。ATM蛋白激酶是DNA損傷修復過程的關鍵調控者，它主要參與：①激活細胞周期檢測點。ATM蛋白激酶參與DNA損傷后，激活多個復雜的細胞周期檢測點，包括：G1/S檢測點、S期檢測點、G2/M檢測點[2]。其信號通路有兩條：一條激活Chk1，Chk1引起CDC25的Ser216磷酸化，通過抑制CDC25的活性，抑制M-CDK的活性，細胞周期中斷；另一條是激活Chk2[3]，使抑癌基因P53被磷酸化而激活。這些活化的P53、Chk2等參與抑制磷酸化Tyr-15位點的脫磷酸化有關，最終使細胞不能通過檢查點“關卡”而導致細胞周期的阻滯。Squatrito[8]等通過對小鼠腦膠質瘤模型研究，發現ATM/Chk2/P53通路成分異常能抑制腫瘤的形成和增加腫瘤對放射線的抵抗性。②DNA的修復。ATM蛋白激酶監視DNA的損傷并且通過磷酸化激活相關的蛋白，調節眾多方面的DNA損失應答過程[4、11]。當ATM蛋白激酶發生突變、失活和功能受損后，細胞缺乏功能正常的ATM蛋白激酶，不能正常修復受損的DNA，受損的DNA很容易隨細胞分裂而傳人子細胞，最終易導致癌變。③參與細胞凋亡。ATM蛋白激酶可以通過調節DNA損失與死亡受體信號傳遞之間的相互作用介導腫瘤細胞凋亡[9]。

Chk2是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，有一定的底物特異性。Chk2是ATM的作用靶點，在DNA損傷后，ATM識別損失信號，繼而使Chk2獲得充分的活性，應對各種原因造成的DNA的損傷[7]。

研究表明在正常乳腺組織的上皮中，ATM蛋白激酶只表達導管上皮分泌細胞，而肌上皮細胞幾乎不表達。而在30%～50%的浸潤性乳腺癌腫瘤細胞中ATM表達下降或缺失[5]。ATM與Chk2在細胞核內調控細胞周期的功能一致[6]。在本研究中，ATM、Chk2在乳腺浸潤性癌中的表達明顯低于正常組織。

DNA損傷導致的細胞凋亡必須要P53的參加，P53基因突變是目前所知人體腫瘤中最常見的基因改變。P53基因突變后不僅喪失抑癌功能，而且具有癌基因的特征。而免疫組化檢測到的是以突變型為主的P53蛋白。在本研究中，P53在在乳腺浸潤性癌中的表達明顯高于正常組織。P53在正常乳腺組織中的表達明顯低于導管內癌，而導管內癌中的表達低于乳腺浸潤性癌。P53與ATM、Chk2表達之間存在顯著負相關[10]。

綜上，ATM蛋白激酶、Chk2、P53的表達及相互之間的關系，它們在乳腺癌發生、進展中的作用，還有待于進一步的研究與探索，還需要進一步加大樣本量，而且對某些技術與方法的應用也有待于進一步的改善、改進和建立。ATM蛋白激酶表達或活性改變涉及了腫瘤的發生，并影響腫瘤的治療及預后，提示ATM蛋白激酶或許能成為腫瘤治療過程中一個新的作用靶點，為腫瘤治療開辟更廣闊的空間。

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Expression and Significance of Cell Cycle Regulators in Breast Intraductal Proliferative Diseases and Breast Carcinoma

WU Tong-tong1, WU Chun-lian1, LUO Jing-hua2,HUANG Zhuo-ya1,YANG Qing-xu1
(1 Department of Pathology, Huizhou Municipal Central Hospital, Huizhou 516001, China; 2 Department of Pharmacy, Huizhou Central Hospital, Huizhou 516001, China)

Objective This study investigate the expression of cell cycle regulators , including ATM、Chk2 and p53 in breast carcinoma. Methods The expressions of ATM、Chk2 and p53 in 63 cases of breast invasive ductal carcinoma (BIDC)、39 cases of breast carcinoma in situ (BIDC)、42 cases of atypical ductal hyperplasia (ADH) and 56 cases of normal breast tissues adjacent to cancer (NBTAC) were observes by SP immunohistochemistry. Results The positive expression levels of ATM and Chk2 in BIDC were significantly lower than NBTAC (P＜0.05). The positive expression level of P53 in BIDC was significantly higher than NBTAC (P＜0.05). Conclusion These results suggest that down-regulation of ATM and Chk2, and over-expression of P53 are significantly related to genesis and progression of breast carcinoma. Combined determination of these three proteins may play an important role in diagnosis and prognosis of breast carcinoma.

R737.9

B

1671-8194（2013）19-0001-02

惠州市科技計劃項目（編號：20110807）