結核桿菌IFN-γ在結核性腦膜炎鑒別診斷中的應用

林正豪 曾劍鋒 劉國輝

（1 深圳市第三人民醫院神經內科，廣東 深圳 518112；2 深圳市第三人民醫院結核科，廣東 深圳 518112）

結核桿菌IFN-γ在結核性腦膜炎鑒別診斷中的應用

林正豪1曾劍鋒2劉國輝2

（1 深圳市第三人民醫院神經內科，廣東 深圳 518112；2 深圳市第三人民醫院結核科，廣東 深圳 518112）

目的 探討外周血結核桿菌抗原特異性 γ 干擾素水平在結核性腦膜炎與隱球菌性腦膜炎鑒別診斷中的作用。方法 回顧性分析本院13 例菌陽結核性腦膜炎、15 菌陰結核性腦膜炎及 11 例隱球菌性腦膜炎患者外周血結核桿菌抗原特異性 γ 干擾素水平差異。結果 菌陽結核性腦膜炎患者外周血結核桿菌抗原特異性 γ 干擾素 9 例陽性，4 例陰性，陽性率 69.2%，菌陰結核性腦膜炎患者外周血結核桿菌抗原特異性 γ 干擾素 10 例陽性，5 例陰性，陽性率 66.7%，隱球菌性腦膜炎患者外周血結核桿菌抗原特異性 γ 干擾素 1 例陽性，10 例陰性，陽性率 0.09%，列聯表資料的 χ2檢驗（χ2=6.78，P=0.001），三組陽性率有差別，經組間兩兩比較，菌陽結核性腦膜炎與菌陰結核性腦膜炎陽性率無顯著性差異（χ2=4.31，P=0.07），菌陽結核性腦膜炎與隱球菌性腦膜炎陽性率有顯著性差異（χ2=7.37，P=0.013），菌陰結核性腦膜炎與隱球菌性腦膜炎陽性率有顯著性差異（χ2=8.26，P=0.024）。結論 外周血結核桿菌抗原特異性 γ 干擾素檢測可作為結核性腦膜炎與隱球菌性腦膜炎早期鑒別診斷的輔助手段。

腦膜炎；結核；隱球菌；γ干擾素；診斷

結核性腦膜炎（Tuberculous meningitis，TBM）是肺外結核重癥，病死率及致殘率均較高，隱球菌性腦膜炎（Cryptococccal neoformans meningitis，CNM）是由新型隱球菌引起的中樞神經系統機會性感染。TBM及CNM患者的臨床經過及腦脊液生化改變十分相似，影像學檢查缺乏特異性，早期病原檢出率低，致使兩者鑒別困難，容易誤診[1]。通過酶聯免疫斑點技術（Elispot）檢測外周血結核分枝桿菌抗原特異性γ干擾素（IFN-γ）在診斷結核菌感染方面具有良好的敏感性及特異性[2]。本文回顧性分析13例菌陽TBM患者、15例菌陰TBM患者及11例CNM患者外周血結核桿菌抗原特異性γ干擾素反應，現將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

所有病例均為我院2011年1月至2012年8月住院患者，菌陽 TBM組腦脊液抗酸染色或結核分枝桿菌培養陽性，菌陰TBM組典型TBM臨床表現、腦脊液改變，腦脊液抗酸染色和結核分枝桿菌培養陰性，經抗結核治療效果顯著，CNM組腦脊液墨汁染色發現隱球菌或腦脊液隱球菌培養陽性。三組患者均無其他器官感染結核桿菌證據。菌陽TBM組13例，男9例，女4例，年齡（27.4±9.1）歲，菌陰TBM組15例，男8例，女7例，年齡（29.4±11.7）歲，CNM組11例，其中男9例，女2例，年齡（25.7±10.1）歲，三組患者性別及年齡分布無明顯差異。

1.2 方法

所有病例均抽取乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝血5mL，送實驗室行Elispot檢測，操作方法參照文獻[3]：采血后2h常規分離外周淋巴細胞，在活化后預包被好抗體的平板中，每孔加入100uL，每孔細胞濃度為2×105cells。背景陰性對照空中不加入任何刺激物。陽性對照每孔加入5uL植物血凝素，終極濃度5ug/mL。實驗孔分別加入結核菌重組蛋白抗原和合成的結核菌多肽抗原（ESAT-6、PoolA、PoolB），終極濃度均為5ug/mL。然后蓋上板蓋，放入37oC、5%CO2培養箱16～24h。緊跟2次洗板和加入檢測抗體孵育，最后加入顯色劑顯色。待顯色洗板后，Elispot斑點計數，并記錄斑點的各種計參數，做統計分析。檢測結果根據斑點數量設定，每一個反應孔中斑點數減去陰性孔中斑點數為檢測結果，結果≥30為陽性，如果結核菌重組蛋白抗原（ESAT-6）、合成的結核菌多肽抗原A （PoolA）和合成的結核菌多肽抗原B （PoolB）3種抗原中任一種抗原檢測結果為陽性，則結果判斷為陽性，3種抗原檢測結果均為陰性，則結果判斷為陰性。

1.3 統計學處理

SPSS13.0統計軟件進行統計分析，各組陽性率比較采用列聯表資料χ2檢驗，P＜0.05認為差異具有統計學意義。

2 結 果

菌陽結核性腦膜炎患者外周血結核桿菌抗原特異性γ干擾素9例陽性，4例陰性，陽性率69.2%，菌陰結核性腦膜炎患者外周血結核桿菌抗原特異性γ干擾素10例陽性，5例陰性，陽性率66.7%，隱球菌性腦膜炎患者外周血結核桿菌抗原特異性γ干擾素陽性率0.09%，經列聯表資料的χ2檢驗（χ2=6.78，P=0.001），三組陽性率有差別，組間兩兩比較，菌陽結核性腦膜炎與菌陰結核性腦膜炎陽性率無顯著性差異（χ2=4.31，P=0.07），菌陽結核性腦膜炎與隱球菌性腦膜炎陽性率有顯著性差異（χ2=7.37，P=0.013），菌陰結核性腦膜炎與隱球菌性腦膜炎陽性率有顯著性差異（χ2=8.26，P=0.024）。見表1。

表1 三組外周血結核桿菌抗原特異性γ干擾素檢測結果

3 討 論

TBM與CNM是由不同病原引起的中樞神經系統感染性疾病，二者均呈亞急性或慢性病程，主要表現為頭痛、嘔吐、發熱，顱神經損害，腦膜刺激征陽性，可引出病理反射，二者的顱內壓、腦脊液ADA與氯化物含量等可能存在差異[4]，臨床上卻很難由此將兩者鑒別開來，病原學檢查仍是重要的鑒別診斷依據，但病原學檢查一般比較費時，陽性率低，往往不能及時提供幫助。TBM臨床表現復雜，癥狀多不典型，早期不易確診[5]。CNM臨床上較少見，腦脊液墨汁染色及培養仍是確診該病的主要手段[6]，患者在腦脊液查及隱球菌之前通常被當成TBM，從而延誤治療，而早期診斷治療對預后至關重要[7]。故臨床上迫切需要新的檢測手段來滿足二者鑒別，Elispot檢測外周血結核分枝桿菌抗原特異性IFN-γ便是近年來發展較快的新一代檢測結核病的免疫學診斷技術。

Elispot技術是IFN-γ釋放試驗中的一種，采用的結核桿菌特異性抗原為ESAT-6和CFP-10，其編碼基因位于RD1區，RD1在卡介苗和絕大多數非結核分枝桿菌的基因組中是缺失的，理論上可以避免結核菌素試驗中影響特異性的PPD交叉抗原，能夠較好地區分真性結核感染和卡介苗接種誘導的反應。在結核桿菌特異性抗原刺激下，測定外周血單個核細胞中能釋放IFN-γ的T淋巴細胞數量，從而判斷機體是否感染結核[8]，該結果不受卡介苗接種的影響，與非結核分枝桿菌無交叉反應，對結核感染具有良好的診斷價值[2]。本實驗應用該技術檢測菌陽TBM患者、菌陰TBM患者及CNM患者外周血核分枝桿菌抗原特異性IFN-γ，結果顯示菌陽結核性腦膜炎患者外周血結核桿菌抗原特異性γ干擾素陽性率69.2%，菌陰結核性腦膜炎患者外周血結核桿菌抗原特異性γ干擾素陽性率66.7%，隱球菌性腦膜炎患者外周血結核桿菌抗原特異性γ干擾素陽性率0.09%，三組陽性率有差別（χ2=6.78，P=0.001），組間兩兩比較，菌陽結核性腦膜炎與菌陰結核性腦膜炎陽性率無顯著性差異（χ2=4.31，P=0.07），菌陽結核性腦膜炎與隱球菌性腦膜炎陽性率有顯著性差異（χ2=7.37，P=0.013），菌陰結核性腦膜炎與隱球菌性腦膜炎陽性率有顯著性差異（χ2=8.26，P=0.024），菌陽及菌陰TBM患者外周血結核桿菌抗原特異性γ干擾素陽性率均較高，CNM患者外周血結核桿菌抗原特異性γ干擾素陽性率較低，當臨床上鑒別TBM、CNM困難時，通過Elispot技術檢測患者外周血核分枝桿菌抗原特異性IFN-γ無疑是有益的補充鑒別手段，值得臨床推廣應用。

臨床上診斷為TBM的患者經治療后，外周血結核桿菌抗原特異性γ干擾素陽性率是否有變化？如有變化，與療效是否相關？需要進一步研究。

當其他系統感染結核、高齡患者、嚴重營養不良、免疫缺陷等有可能影響外周血核分枝桿菌抗原特異性IFN-γ檢測結果的準確性，臨床分析結果時要綜合考慮上述情況。

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Application of Mycobacterium Tuberculosis IFN-γresponses in Differential Diagnosis of Tuberculous Meningitis

LIN Zheng-hao1, ZENG Jian-feng,2, LIU Guo-hui2
(1 Department of Neurology, Shenzhen Third People’s Hospital , Shenzhen 518112, China; 2 Department of Tuberculosis Division, Shenzhen Third People’s Hospital, Shenzhen 518112, China)

ObjectiveTo discuss clinical application of Mycobacterium tuberculosis antigen specific IFN-γresponses in antidiastole between tuberculous meningitis and cryptococal neoformans meningitis.MethodsIFN-γ responses in peripheral blood of 13 patients with csf positive tuberculous meningitis , 15 patients with csf negative tuberculous meningitis and 11 patients with cryptococal neoformans meningitis were tested and then analyzed retrospectively.ResultsPositive IFN-γ responses were detected in 69.2%(9/13)of patients with csf positive tuberculous meningitis, 66.7%(10/15)of patients with csf negative tuberculous meningitis and 9.0%(1/11) of patients with cryptococal neoformans meningitis. IFN-γ responses in the three groups is statistically different(χ2=6.78,P=0.001). Through the comparison between the two two groups, IFN-γ responses positive rate between csf positive tuberculous meningitis patients and csf negative tuberculous meningitis patients is not statistically different(χ2=4.31,P=0.07). IFN-γ responses positive rate between csf positive tuberculous meningitis patients and cryptococal neoformans meningitis patients is statistically different(χ2=7.37,P=0.013). IFN-γ responses positive rate between csf negative tuberculous meningitis patients and cryptococal neoformans meningitis patients is statistically different(χ2=8.26,P=0.024).ConclusionIFN-γresponses in peripheral blood can be used as an assistant means to discriminate cryptococal neoformans meningitis from tuberculous meningitis.

Meningitis ; Tuberculosis; Neoformans; IFN-γ; Diagnosis

R515.2

：B

：1671-8194（2013）10-0004-02

深圳市科技計劃項目（編號：201202062）