補(bǔ)骨脂丙酮提取物對(duì)骨質(zhì)疏松癥的治療作用及其機(jī)制初探

高植明

（珠海市人民醫(yī)院藥學(xué)部，廣東 珠海 519000）

補(bǔ)骨脂丙酮提取物對(duì)骨質(zhì)疏松癥的治療作用及其機(jī)制初探

高植明

（珠海市人民醫(yī)院藥學(xué)部，廣東 珠海 519000）

目的 考察補(bǔ)骨脂丙酮提取物的抗骨質(zhì)疏松作用及其機(jī)制。方法 采用大鼠去卵巢骨質(zhì)疏松模型，通過影像學(xué)、形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)方法考察補(bǔ)骨脂丙酮提取物的抗骨質(zhì)疏松作用及其機(jī)制。結(jié)果 模型組的骨密度明顯下降（P＜0.05）；而H0高、中劑量組則顯著提升（P＜0.05）。HE染色顯示：模型組股骨骨小梁遭到嚴(yán)重破壞，而仙靈骨葆組、H0高、中劑量組骨小梁網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的完整性好。熒光定量PCR顯示，模型組股骨β-ERmRNA水平與對(duì)照組沒有顯著差異。結(jié)論 補(bǔ)骨脂丙酮提取物H0組分高、中劑量組初步顯示抗骨質(zhì)疏松特性，其機(jī)制與骨組織里β型雌激素受體無關(guān)。

補(bǔ)骨脂丙酮提取物；骨質(zhì)疏松；分子機(jī)制

骨質(zhì)疏松癥（Osteoporosis，OP）是以骨量減少、骨微觀結(jié)構(gòu)退化為特征的一種全身性骨骼疾病，臨床表現(xiàn)為骨的脆性增加，易發(fā)生骨折。在整個(gè)生命周期中，骨質(zhì)在不停的形成和破壞，維持著一種動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)骨吸收與骨形成的偶聯(lián)中出現(xiàn)缺陷，骨吸收大于骨形成，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松發(fā)生。它好發(fā)于老年人和絕經(jīng)后婦女。患者以長(zhǎng)骨斷裂性骨折和扁骨壓縮性骨折為常見，導(dǎo)致身高變矮，駝背，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量。尤其是絕經(jīng)后婦女發(fā)病率更高。本實(shí)驗(yàn)通過結(jié)扎并摘除12月齡雌性大鼠雙側(cè)卵巢，模擬人絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥狀，借助影像學(xué)、組織形態(tài)學(xué)手段，考察補(bǔ)骨脂油脂部分防治大鼠骨質(zhì)疏松的作用，通過熒光定量PCR等分子生物學(xué)手段，初步探索其作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 藥品與試劑

仙靈骨葆膠囊（批號(hào)：100811，0.5g×40粒）），貴州同濟(jì)堂制藥有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

成熟補(bǔ)骨脂種子500g，清平市場(chǎng)購買；丙酮，分析純；正丁醇，分析純；乙酸乙酯，分析純；硅膠300g，分析純。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)12月齡SD雌性大鼠90只（體質(zhì)量375±25g），由廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：0037852，許可證號(hào)：SCXK（粵）2003-0002，粵監(jiān)證字2009A003。

1.4 儀器

LUNAR PRODIGY雙能X射線骨密度儀（通用公司）；ENCORE10.0分析軟件（通用公司）；光學(xué)顯微鏡（奧林巴斯公司）；7500全自動(dòng)熒光定量PCR儀（ABI公司）。

1.5 研究方法

1.5.1 補(bǔ)骨脂油脂部分的提取：提取方法：成熟補(bǔ)骨脂種子500g在粉碎機(jī)中粉碎好，倒進(jìn)容積為3L的四口圓底燒瓶中，加入丙酮（2L）提取，在水浴鍋中保持丙酮微沸狀態(tài)回流7h后，減壓濃縮，將所得的提取物的一部分（10g）轉(zhuǎn)移至灌以500g硅膠的層析柱，用正丁醇和乙酸乙酯按不同比例組合的洗脫液洗脫（10∶0，10∶1，5∶1和0∶10），最終獲得用2L正丁醇（10∶0）洗脫出來的組分H0和用2L正丁醇-乙酸乙酯洗脫液（10∶1）洗脫出來組分H1，這兩種無色油類組分即為補(bǔ)骨脂丙酮提取物的非極性部分。其余比例洗脫液的洗脫成分為極性成分，舍去。

1.5.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：取12月齡SPF級(jí)的雌性SD大鼠90只，隨機(jī)分成9組，每組10只大鼠，再隨機(jī)抽出兩組分別作為對(duì)照組和假手術(shù)組，其余8組行結(jié)扎并摘除雙側(cè)卵巢手術(shù)，分別為模型組、陽性對(duì)照組（雌激素）、H0-h（高劑量）、H0-m（中劑量）、H0-l（低劑量）、H1-h（高劑量）、H1-m（中劑量）、H1-l（低劑量），假手術(shù)組除了不摘除卵巢外其余處理同模型組。手術(shù)一周后開始每天灌胃給藥，對(duì)照組、假手術(shù)組、模型組分別灌以等量的生理鹽水，其余各組灌以相應(yīng)劑量的藥物[16]：H0-h（高劑量）90mg/（kg·d）；H0-m（中劑量）30mg/（kg·d）；H0-l（低劑量）10mg/（kg·d）；H1-h（高劑量）90mg/（kg·d）； H1-m（中劑量）30 mg/（kg·d）；H1-l（低劑量）10mg/（kg·d）。灌胃容量控制在約2mL/只，每周稱量體質(zhì)量一次，根據(jù)體質(zhì)量調(diào)整劑量。常規(guī)飼養(yǎng)，12周后殺動(dòng)物取材，檢測(cè)相應(yīng)指標(biāo)。

表2 補(bǔ)骨脂丙酮提取物對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠股骨組織雌激素受體的影響（）

表2 補(bǔ)骨脂丙酮提取物對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠股骨組織雌激素受體的影響（）

注：與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01；B=copy/μL cDNA；A=B（ER β）÷B（GAPDH）

組別例數(shù)劑量(mg/kg)B(ERβ)(104copy/μL cDNA)B(GAPDH)(103copy/μL cDNA)A(10-3)t值對(duì)照組8—1009.3±1003.211316.3±7343.188.7±104.31.677模型組8—150.2±114.17178.2±7618.365.7±94.6—仙靈骨葆組712086.1±62.32109.7±2220.3375.2±512.51.421 H0高劑量組890198.5±49.761617.3±43481.69.2±11.31.451 H0中劑量組930282.4±46.124924±29572.354.4±58.20.251 H0低劑量組101087.1±19.87758.3±5738.723.0±24.31.073 H1高劑量組89084.2±53.620629±29425.116.3±16.11.261 H1中劑量組1030195.1±161.04109.8±4931.21190.6±2061.31.335 H1低劑量組71092.1±31.214951.1±22234.399.1±114.20.544

1.6 骨密度的測(cè)量

宰殺動(dòng)物前，稱取大鼠體質(zhì)量，以3%戊巴比妥鈉40mg/kg腹腔注射麻醉，把大鼠四肢伸展俯臥于通用公司LUNAR PRODIGY雙能X射線骨密度儀上，測(cè)量全身BMD，用ENCORE10.0分析軟件分析。

1.7 股骨干骺端的矢狀面的HE染色觀察

每組隨機(jī)抽取4只大鼠的左股骨，取股骨下1/3段，浸泡于10%的中性甲醛中，4℃固定72h，固定液為樣本體積的5倍以上，5%硝酸脫鈣24h，然后按50%、70%、80%、90%、100%乙醇梯度脫水，每級(jí)15min，二甲苯透明24h后，常規(guī)石蠟包埋，在冷凍切片機(jī)上沿股骨干骺端矢狀面按4μm連續(xù)切片，HE染色，40倍光學(xué)顯微鏡下觀察骨松質(zhì)顯微結(jié)構(gòu)的變化。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 補(bǔ)骨脂丙酮提取物對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠骨密度的影響，見表1。

表1 補(bǔ)骨脂丙酮提取物對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠骨密度的影響（）

表1 補(bǔ)骨脂丙酮提取物對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠骨密度的影響（）

注：與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01

組別例數(shù)劑量(mg/kg)骨密度(10-2g/cm2)t值對(duì)照組8-17.4±0.6**5.599模型組8-16.7±0.3-仙靈骨葆組712016.7±0.80.684 H0高劑量組89017.7±0.9**3.424 H0中劑量組93017.6±0.8**3.535 H0低劑量組101017.3±0.62.032 H1高劑量組89016.9±0.22.081 H1中劑量組103017.2±0.91.645 H1低劑量組71017.0±0.71.557

從表1可見，假手術(shù)組與對(duì)照組相比骨密度和骨礦含量沒有顯著差異；模型組與對(duì)照組相比，骨密度含量下降具有顯著性差異（BMD：P＜0.01）。

2.2 補(bǔ)骨脂丙酮提取物對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠股骨干骺端骨松質(zhì)的HE染色觀察（40×）的影響，見圖1。

2.3 補(bǔ)骨脂丙酮提取物對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠股骨組織雌激素受體的影響，見表2。

由表2可知，模型組的ERβmRNA水與假手術(shù)組沒有顯著差異，提示摘除雙側(cè)卵巢誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松大鼠體內(nèi)ERβmRNA水平?jīng)]有變化。

3 討 論

圖1 去卵巢大鼠股骨的在光學(xué)顯微鏡下觀察的病理變化（HE染色×40）

OVX大鼠模型的是骨質(zhì)疏松實(shí)驗(yàn)的金標(biāo)準(zhǔn)，具有重現(xiàn)性好，機(jī)制明確等特點(diǎn)，特別適用絕境后骨質(zhì)疏松的藥物治療研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，OVX模型的骨密度顯著低于對(duì)照組，表明造模成果。陽性對(duì)照藥仙靈骨葆膠囊，是治療骨質(zhì)疏松的常用中成藥，療效在業(yè)界中得到廣泛的認(rèn)可[1-6]，本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，仙靈骨葆在12周預(yù)防治療中并沒明顯改善OVX大鼠的骨密度，而HE染色顯示，接受仙靈骨葆干預(yù)后，大鼠的股骨骨干骺端的骨小梁網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)明顯比模型組的要完整。初步分析原因有二，一是由于仙靈骨葆膠囊內(nèi)容物為浸膏干粉，溶解性差，定量容易有系統(tǒng)偏差，二是有研究指出，仙靈骨葆治療老年性骨質(zhì)疏，雖然能較好維持骨密度，但作用緩慢，連續(xù)治療12個(gè)月開始改變骨密度的下降趨勢(shì)，連續(xù)治療24個(gè)月后骨密度才明顯上升[7]。因此，雖然定性指標(biāo)（HE染色）反應(yīng)出差異，但還不足以體現(xiàn)在量的區(qū)別上，若今后改進(jìn)為應(yīng)用仙靈骨葆片劑，提升藥物溶解性和生物利用度，或加大給藥劑量，同時(shí)延長(zhǎng)藥物干預(yù)時(shí)間，有望克服以上問題。補(bǔ)骨脂對(duì)骨質(zhì)疏松的治療作用已被學(xué)術(shù)界認(rèn)可[8-15]，它有雌激素樣作用，能防止骨吸收，增加骨密度，但補(bǔ)骨脂的成分復(fù)雜，其治療骨質(zhì)疏松的有效成分一直不夠明確，作用機(jī)理不夠清晰，腎毒性和光毒性等不良反應(yīng)也一直制約著補(bǔ)骨脂的發(fā)展前景[16-19]，故有必要對(duì)其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行研究，闡明其活性成分，對(duì)其進(jìn)行有效的提取、純化、制成現(xiàn)代制劑和進(jìn)行有效的質(zhì)量控制，才能提煉出療效顯著，并毒性最低的成分。吉力[20]等對(duì)補(bǔ)骨脂中35種化學(xué)成分作過綜述，對(duì)補(bǔ)骨脂油脂性提取物的研究在國內(nèi)外卻極為罕見。Miura H[21]發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)骨脂的油脂部分能增加3周齡佝僂病大鼠的骨強(qiáng)度，提高血中無機(jī)磷酸鹽水平；Zaka的研究首次明確了補(bǔ)骨脂油脂部分的成分是三酰甘油、二酰甘油、單酰甘油及游離脂肪酸[22]。但其增強(qiáng)骨組織強(qiáng)度的作用機(jī)制尚不明確。顯然，Miura H的研究結(jié)果明確了補(bǔ)骨脂油脂部分具備顯著的促進(jìn)大鼠骨骼礦化的作用，而這種促礦化作用沒有性別和月齡的界限。因此我們有理由相信，這種物質(zhì)同樣適用于成年大鼠的骨質(zhì)疏松模型的治療上，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，補(bǔ)骨脂油脂部分的H0組分的高劑量組和中劑量組明顯提高了OVX大鼠的骨密度，HE染色也顯示，H0組分干預(yù)的OVX大鼠的股骨干骺端骨小梁網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)較完整，初步體現(xiàn)出H0組分的抗骨質(zhì)疏松能力。激素受體分為兩種亞型：α型和β型；α型廣泛分布在卵巢、子宮等女性器官，是雌激素替代療法致癌的根源，β型雌激素受體大量分布在骨組織中，主導(dǎo)成骨細(xì)胞的活性，促進(jìn)骨形成，提高骨密度。骨組織里的β型雌激素受體mRNA水平的變化，與骨質(zhì)疏松的發(fā)病機(jī)制以及藥物干預(yù)機(jī)制息息相關(guān)，而熒光定量PCR是當(dāng)今最先進(jìn)的PCR定量技術(shù)之一，適合于任何組織的mRNA水平定量。本實(shí)驗(yàn)顯示模型組股骨組織里的β型雌激素受體mRNA水平的變化與對(duì)照組沒顯著差異，證明本實(shí)驗(yàn)的大鼠骨質(zhì)疏松模型與此機(jī)制無關(guān)。

綜上所述，補(bǔ)骨脂丙酮提取物提取H0組分在大鼠實(shí)驗(yàn)中初步體現(xiàn)出抗骨質(zhì)疏松特性，但作用靶點(diǎn)以及機(jī)制仍未完全闡釋清楚，并存在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)需要改進(jìn)、研究樣本小等問題，以后應(yīng)加強(qiáng)這方面的科研投入。

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Effects and Mechanism of Psoralen Acetone Extract on Osteoporosis

GAO Zhi-ming
(Department of Pharmacy, Zhuhai People's Hospital, Zhuhai 519000, China)

Objective To study preventive effects and mechanism of Psoralen acetone extract on osteoporosis. Methods Ovariectomized rats were used as the model of osteoporosis,and preventive effects and mechanism of Psoralen acetone extract on osteoporosis were investigated by the methods of radiology, morphology, molecular biology.Result The BMD of model group decreased significantly(P＜0.05) , while H0 groups with high dose and middle dose were significantly increased (P＜0.05). HE staining showed that: femoral trabecular bone of model group was severely damaged, but that of Xianlinggubao group, H0 groups with high dose and middle dose had kept a well shape of mesh. Fluorescent quantitation PCR showed that right femur of rats of β-type estrogen receptor mRNA levels were not significantly different comparing with the control group. Conclusion The Psoralen acetone extract H0 at high dose and middle dose showed effects against osteoporosis of rats. The mechanism of anti-osteoporosis of H0 component had nothing to do with the β-type estrogen receptor in osteoblasts.

Psoralen acetone extract; Osteoporosis; Molecular mechanisms

R282.710.7；R589.5

B

1671-8194（2013）31-0001-03

廣東省中醫(yī)藥局建設(shè)中醫(yī)藥強(qiáng)省基金項(xiàng)目(No.20112039)支持