人參皂苷Rh2逆轉MCF-7/ADM多藥耐藥性的研究

李 萍陳 善

（1 吉林亞泰制藥股份有限公司研發部，吉林 長春 130033；2 總后衛生部藥品儀器檢驗所，北京 100071）

人參皂苷Rh2逆轉MCF-7/ADM多藥耐藥性的研究

李 萍1陳 善2

（1 吉林亞泰制藥股份有限公司研發部，吉林 長春 130033；2 總后衛生部藥品儀器檢驗所，北京 100071）

目的 觀察人采用人參苷Rh2對逆轉人乳腺癌多藥耐藥細胞株MCF-7/ADM的分子機制。方法 采用MTT比色法對不同濃度下人參皂苷Rh2對MCF-7/ADM的阿霉素（ADM）以及氟尿嘧啶(Fu)耐藥逆轉指標檢測，同時使用多功能酶標儀檢測人參皂苷Rh2干預對細胞內羅丹明123熒光強度以反映其對細胞多藥耐藥蛋白P-gp活性的影響。結果 經過人參皂苷Rh2的干預，MCF-7/ADM對ADM以及Fu兩種臨床常用化療的敏感性增強。另外，人參皂苷Rh2還對細胞的羅丹明123外排有顯著的濃度依賴性抑制作用。結論 人參皂苷Rh2能夠有效逆轉MCF-7/ADM多藥耐藥性，其作用機制可能主要為抑制了細胞多藥耐藥蛋白P-gp的活性。

人參皂苷Rh2；人乳腺癌多藥耐藥細胞株；多藥耐藥性

乳腺癌是所有女性腫瘤發病率中最高的一類惡性腫瘤，化療是目前針對中晚期乳腺癌患者的臨床治療首選[1]。但隨著研究的增加，發現治療一段時間后，患者的化療效果開始出現下降趨勢。研究認為[2]，其主要原因為腫瘤細胞產生了耐藥性。多藥耐藥（MDR）是最為常見的一種根據耐藥譜劃分的一種耐藥[3]。MDR產生的主要機制和多藥耐藥基因編碼P-gp的表達存在密切關系，P-gp高表達，能夠與用于腫瘤細胞的化療藥物進行結合，最終使得化療藥物排出細胞外，降低化療的作用[4-6]。人參皂苷Rh2是中藥人參的提取物，臨床研究認為其有提高患者自身免疫力，增強抗瘤能力的作用[7]。本研究就人參皂苷Rh2對經阿霉素（ADM）以及氟尿嘧啶（Fu）干預下人乳腺癌多藥耐藥細胞株MCF-7/ADM的生長進行了觀察，試圖闡述人參皂苷Rh2逆轉MCF-7/ ADM多藥耐藥性的分子作用機制。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 一般材料

實驗材料主要包括ADM，10mg/支，購自深圳萬樂藥業有限公司提供；Fu，0.25g/10mL，購自南通精華制藥股份有限公司；人參皂苷Rh2，純度＞98%，使用二甲基亞砜（DMSO）對其進行溶解，配置成為20mg/mL規格的稀釋液待用；羅丹明123以及四甲基偶氮唑鹽（MTT） 購自美國Sigma公司；人乳腺癌多藥耐藥細胞株MCF-7/ADM，由中南大學湘雅醫學院細胞中心所提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 MCF-7/ADM細胞培養

將MCF-7/ADM放置于10%小牛血清的RPMI 1640培養基中，培養基中適當加入青霉素，劑量為100U/L。培養條件為5%CO2濃度以及37℃下。對MCF-7/ADM細胞中的ADM濃度進行每日一次的檢測，維持ADM濃度在1.0mg/L。當濃度不足時，進行適當加藥，以維持細胞的耐藥性。MCF-7/ADM細胞兩天進行一次培養液的更換，另外，3～4d進行一次傳代。進行實驗前兩周，撤除ADM的干預，使得MCF-7/ADM細胞處于化療藥物的培養基中，兩周后即可使用。

1.2.2 MTT檢驗

MTT檢驗能夠對MCF-7/ADM中的存活細胞數進行檢測，使用方法如下：對對數期生長的MCF-7/ADM細胞進行收集，選擇100μL的移液槍進行吸取，吸取量為100μL，大約含有1×104個MCF-7/ADM細胞。吸取細胞后接種于96孔的培養板內，培養板靜置培養12h。12h后，如見孔底基本被細胞單層所鋪滿時，即可進行分組加藥。加藥組分為不同濃度的ADM以及Fu組（濃度分別為2.50，5.00，10.00，20.00以及40.00mg/L）以及不同濃度的人參皂苷Rh2組（濃度分別為5、10、20以及40μmol/）。同時設立不加任何藥物的對照組，每組均設置復孔5個，使用200μL的移液槍吸取細胞培養液，吸取量為200μ。細胞培養液加入結束后，將培養板繼續培養48h。48h后使用移液槍吸入20μL的MTT溶液，加入每個孔內，MTT溶液的濃度為5g/L。之后將培養板放入5%CO2濃度以及37℃下的培養箱中，進行4h的培養。4h后拿出，并吸出每個孔內的細胞培養液，然后使用移液槍吸取150μL的DMSO加入到每個孔內。完成后將培養板放置于搖床上，進行10min的低速搖動、振蕩，讓每個孔內產生的結晶得到完全的溶解。采用酶標儀進行各孔吸光度（OD值）的測定，波長設置為578nm。對每個孔內的MCF-7/ADM細胞抑制率，具體計算方法如下：細胞抑制率（%） =（1-實驗孔OD值/對照孔OD值）×100%。

1.2.3 羅丹明123排出實驗

羅丹明123屬于P-gp的一類特異性較高的熒光底物，因此，可以通過對MCF-7/ADM細胞內羅丹明123的含量進行測定，以確定人參皂苷Rh2對P-gp活性抑制的作用及具體效率。檢測主要通過使用熒光光度計對MCF-7/ADM細胞內的熒光強度進行測定，通過公式計算出羅丹明123外排抑制的情況。公式如下：人參皂苷Rh2對羅丹明123外排抑制效率（%）=（經人參皂苷Rh2處理的熒光強度-對照組的熒光強度）/對照組的熒光強度×100%。具體的檢查方法如下：①對對數期生長的MCF-7/ADM細胞進行收集，選擇100μL的移液槍進行吸取，吸取量為200μL，大約含有1×104個MCF-7/ADM細胞。吸取細胞后接種于96孔的熒光板內，熒光板板靜置培養24h。24h后每孔均加入羅丹明123，濃度為1mg/L。之后將熒光板放置于5%CO2濃度以及37℃下的培養箱中培養20min左右。根據人參皂苷Rh2濃度的不同進行分組觀察。實驗組設置7個小組，為不同濃度的人參皂苷Rh2組（濃度分別為1，5，10，20，50以及100μmol/L）。對照組加入等體積的RPMI 1640培養液。每個小組均設置5個復孔。之后將熒光板放置于5%CO2濃度以及37℃下的培養箱中培養4h左右。4h后采用D-Hanks清洗液加入每個熒光孔內，靜置1min后倒出，相同方法再進行一次清洗。清洗后將熒光板放入0.3mol/L HCl以及50%乙醇配制而成的消化液中，并放置于4℃冰箱中過夜。熒光強度的測定利用多功能酶標儀進行，激發波長設定在485nm，發射波長設定在538nm。

1.3 統計學方法

上述實驗方法重復進行3次，應用SPSS 14.0軟件。計量資料以（χ—±s）表示，均數比較采用t檢驗、方差因素分析，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 人參皂苷Rh2干預ADM抑制MCF-7/ADM細胞生長情況

結果表明，隨著ADM藥物濃度的提高，可以發現對MCF-7/ ADM細胞生長的抑制情況明顯的上升。對人參皂苷Rh2干預前后相同濃度的ADM對MCF-7/ADM細胞的抑制率進行分析，可以發現結果人參皂苷Rh2進行干預后對細胞的抑制率顯著上升（P＜0.01）。數據見表1。

表1 人參皂苷Rh2干預ADM抑制MCF-7 /ADM細胞生長情況（例，χ—±s）

2.2 人參皂苷Rh2干預Fu抑制MCF-7/ADM細胞生長情況

結果表明，隨著Fu藥物濃度的提高，可以發現對MCF-7/ADM細胞生長的抑制情況明顯的上升。對人參皂苷Rh2干預前后相同濃度的Fu對MCF-7/ADM細胞的抑制率進行分析，可以發現Fu（5，10mg/L）對進行干預后對細胞的抑制率顯著上升（P＜0.01）。數據見表2。

2.3 羅丹明123排出實驗分析

結果表明，當人參皂苷Rh2＞10μmol/L時，干預組的熒光強度明顯高于對照組（P＜0.01）。數據見表3。

3 討 論

3.1 MDR發生機制

MDR是目前臨床治療各類惡性腫瘤患者最為嚴重的療效問題，也是嚴重影響惡性腫瘤患者生存率的問題。因此，降低MDR的發生，提高腫瘤細胞對化療的敏感程度，就成為了當前腫瘤研究最主要的方向[8-9]。目前國內外的研究均認為[10-11]，多藥耐藥基因（MDR1）編碼的P-gp蛋白是MDR產生的重要機制。P-gp蛋白的主要功能是轉運細胞內部的多種物質，例如內源性激素、異生物以及肽類等。另外，P-gp蛋白還具有氯離子通道的作用。因此當某些帶有陽離子的化療藥物進行已經產生耐藥性的細胞時，P-gp可以和相關化療藥物進行一系列化學結合，最終在相鄰的兩個蛋白之間形成一個離子通道。該離子通道對正電荷有不同的反應，當負電荷的Cl-進入腫瘤細胞時，離子通道會識別并讓其通過。而當正電荷的化療藥物進入腫瘤細胞時，離子通道同樣會識別，通過ATP水解后得到的能量將帶有正電荷的化療藥物排出到腫瘤細胞外。最終的結果就是細胞內的化療藥物濃度較低，對腫瘤細胞的殺傷能力有限，并使得腫瘤細胞得到一定的耐藥性[12]。

表2 人參皂苷Rh2干預Fu抑制MCF-7/ADM細胞生長情況(例,χ—±s)

表3 羅丹明123排出實驗分析（例，χ—±s）

3.2 MDR抑制研究

P-gp蛋白的高表達被認為是MDR發生的高危因素，因此，如果對P-gp介導的MDR進行抑制就成為治療各類惡性腫瘤的關鍵。國內外已有文獻表明[13-14]，目前已經發現了多種天然或人工合成的化合物有一定的抑制P-gp蛋白表達能力。人參皂苷Rh2屬于天然植物人參的根部提取物，有學者在對人口腔上皮癌（KBV20C）進行人參皂苷Rh2干預，發現經過人參皂苷Rh2干預后的KBV20C細胞對化療藥物的敏感程度明顯得到增強。并認為是通過和P-gp底物（化療藥物）發生了競爭性結合，從而降低了P-gp與化療藥物的結合，從而達到逆轉耐藥性的作用[15]。本研究就人參皂苷Rh2對逆轉人乳腺癌多藥耐藥細胞株MCF-7/ADM的分子機制進行實驗研究，結果表明，人參皂苷Rh2+ADM組和ADM組比較，MCF-7/ADM細胞的生長得到了明顯的抑制（P＜0.01）。另外，當Fu（5，10mg/L）+人參皂苷Rh2，與不加人參皂苷Rh2的對照組比較，MCF-7/ADM細胞的生長得到了明顯的抑制（P＜0.01）。均提示人參皂苷Rh2是一種較好的MDR逆轉劑。另外，我們采用羅丹明123排出實驗對P-gp的特異性熒光底物進行檢測。結果發現加入人參皂苷Rh2后，能夠明顯提高MCF-7/ADM細胞中羅丹明123的濃度。結果與MTT檢驗的結果相一致，均說明人參皂苷Rh2能夠逆轉MCF-7/ADM細胞的耐藥性，從而增加化療藥物對腫瘤的殺傷作用。

綜上所述，人參皂苷Rh2能夠明顯逆轉體外培養的MCF-7 /ADM細胞的化療藥物耐藥性，并且知道其機制是通過抑制P-gp蛋白的表達來達到。因此，人參皂苷Rh2有望成為臨床新型的抗腫瘤藥物。

[1] 朱君榮,孫建國,謝海棠,等.人參皂苷-Rh2對人乳腺癌T47D細胞的生長抑制作用及對Caspase-3表達的影響[J].中國臨床藥理學與治療學,2007,12(6):630-634.

[2] 黃景嘉.人參皂苷Rh2及其新型衍生物誘導乳腺癌MCF-7細胞凋亡的分子調控機制[D].長沙:中南大學,2010.

[3] 李羅絲.人參皂苷Rh2誘導HL-60細胞凋亡的信號轉導機理[D].長沙:中南大學,2006.

[4] Li Yu,Peng S.A Variant of Human Estrogen Receptor-α,hER-α36 Weakens Docetaxel Drug Efficacy against Human Breast Cancer Cell Line MCF-7[J].中國癌癥研究(英文版),2009,21(4):325-332.

[5] Han WD,Wu ZQ,Zhao YL,et al.FHL2 Antagonizes Idl-Promoted Proliferation and Invasive Capacity of Human MCF-7 Breast Cancer Cells[J].中國癌癥研究(英文版),2011,22(3):194-200.

[6] Chen YH,Wu ZQ,Zhao YL,et al.FHL2 inhibits the Id3-promoted proliferation and invasive growth of human MCF-7 breast cancer cells[J].中華醫學雜志(英文版),2012,125(13):2329-2333.

[7] Han WD,Wu ZQ,Zhao YL,et al.FHL2 Antagonizes Id1-Promoted Proliferation and Invasive Capacity of Human MCF-7 Breast Cancer Cells[J].中國癌癥研究(英文版),2010,22(3):194-200.

[8] 劉玉華,洪理泉,於王騏,等.miR-15a誘導人乳腺癌細胞MCF-7凋亡的作用機制[J].中華腫瘤雜志,2011,33(11):827-830.

[9] 蘆金榮,桂力,沙磊,等.具有選擇性雌激素受體調節活性的大豆苷元衍生物的合成及生物活性研究[J].有機化學,2011,31(11): 1852-1863.

[10] 葛雅琨,張元新,陳云鵬,等.Nutlins類似物NL-608誘導人乳腺癌MCF-7細胞凋亡[J].中華腫瘤雜志,2012,34(2):100-103.

[11] 林芳,錢之玉,薛紅衛,等.青蒿素和青蒿琥酯對人乳腺癌MCF-7細胞的體外抑制作用比較研究[J].中草藥,2003,34(4):347-349.

[12] 肖錫崗,房林,李華,等.酪蛋白激酶Ⅱ抑制劑促進MCF-7乳腺癌細胞凋亡[J].中華實驗外科雜志,2011,28(12):2121-2123.

[13] 黃瀚,李兵,歐陽林旗,等.葉酸受體及二氫葉酸還原酶與人乳腺癌細胞MCF-7/ADR多藥耐藥的關系[J].中國藥理學通報,2011, 27(1):99-103.

[14] 王秀麗,孔力,趙瑾瑤,等.三氧化二砷逆轉人乳腺癌MCF-7/ADM細胞耐藥的機制研究[J].中華腫瘤雜志,2002,24(4):339-343.

[15] 王妍,張蓮芬,馮磊,等.人乳腺癌細胞系MCF-7/W和MCF-7/ADM細胞中阿霉素結合蛋白的分析[J].中國藥理學通報,2007,23(9): 1188-1193.

Study of the Ginsenoside Rh2 Reversal MCF-7/ADM Multidrug Resistance

LI Ping1, CHEN Shan2
(1 Department of Research and Development, Jilin Yatai Pharmaceutical Incorporated Company, Changchun 130033, China; 2 The Ministry of Health Bureau Drug Inspection Instrument, Beijing 100071, China)

Objective To observe the molecular mechanism of the ginsenoside Rh2 to reverse the multidrug resistance of human breast cancer cell lines MCF-7/ADM. Methods Using MTT colorimetric method to test the resistance reversal index of MCF-7/ADM to adriamycin (ADM) and fluorouracil (Fu) by different concentrations of ginsenoside Rh2.,at the same time use muti-function eliasa to detect ginsenoside Rh2 intervention on cellular rhodamine 123 to reflect the fluorescence intensity of drug-resistant cell protein P - gp active influence. Results After ginsenoside Rh2 intervention, sensitivity of MCF - 7 / ADM to ADM and Fu which were two clinical commonly used chemotherapy medicines had been enhanced. In addition, the cell effluen of rhodamine 123 was significantly inhibited by the ginsenoside Rh2 with concentration dependence. Conclusion The ginsenoside Rh2 can effectively reverse the multidrug resistance of MCF-7/ADM,and its mechanism may mainly for the inhibition of the activity of drug resistance protein P-gp.

Ginsenoside Rh2; Human breast cancer multidrug resistant cell line; Multidrug resistance

R737.9

B

1671-8194（2013）21-0008-03