Ang-2和VEGF在類風濕關節炎滑膜組織中的表達研究

劉志昂 張 楠

（鄭州人民醫院骨科，河南 鄭州 450053）

Ang-2和VEGF在類風濕關節炎滑膜組織中的表達研究

劉志昂 張 楠

（鄭州人民醫院骨科，河南 鄭州 450053）

目的 研究Ang-2和VEGF在類風濕關節炎滑膜組織中的表達及其對類風濕關節炎血管新生和病情進展的意義。方法 選取34例RA和30例OA患者的滑膜組織，分別用免疫組化方法檢測Ang-2和VEGF在類風濕關節炎滑膜組織中的表達水平及二者的相關性。結果 RA滑膜組織襯里層與襯里下層的成纖維細胞、巨噬細胞樣細胞、血管內皮細胞均見Ang-2和VEGF的陽性表達分布，兩者比較，陽性細胞的染色程度、染色細胞數與分布范圍大致相等。RA患者滑膜Ang-2和VEGF表達水平明顯高于對照組。結論 Ang-2和VEGF與RA的發生、發展密切相關，VEGF可能通過上調Ang-2促進RA的血管新生.阻抗Ang-2和VEGF有望成為類風濕關節炎治療新的靶點。

類風濕關節炎；Ang-2；VEGF；免疫組織化學

類風濕關節炎是以累及周圍關節為主、多系統損傷的自身免疫系統疾病。它的基本病理改變是慢性滑膜炎，滑膜增生肥厚及軟骨血管翳生成引起關節病變、軟骨破壞。血管生成過程受多種因子的調節。其中，血管生成素-2（Ang-2）在胚胎發育、女性生殖系統及糖尿病眼病、腫瘤浸潤轉移、創傷愈合等的血管新生中發揮重要作用，而在RA中的研究很少。我們應用免疫組化方法檢測Ang-2和VEGF在RA滑膜組織中的表達情況，探討Ang-2、VEGF表達的意義以及二者之間的聯系。

1 材料與方法

1.1 標本來源及制備

34例RA滑膜取自2005年7月至2011年9月骨科關節鏡下滑膜清理或關節置換的RA患者，其中男11例，女23例；膝關節28例，髖關節6例，所有病例均符合美國類風濕協會（ARA）1987年制定的新標準。30例OA滑膜取自同期行骨關節炎手術患者。標本均經 10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，常規制備4μm厚連續切片。

1.2 試劑、過程與方法

兔抗人Ang-2（BAO-0636）、VEG多克隆抗體、即用型SABC免疫組化染色試劑盒、DAB顯色試劑盒購自武漢博士德公司。采用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶標免疫組織化學法（S-P法），所有切片染色按相同條件進行。已知染色陽性的人臍帶組織作為陽性對照，PBS置換一抗作為陰性對照。

1.3 結果判斷標準

Ang-2、VEGF免疫組化染色以細胞漿著色成棕黃色或棕褐色為陽性表現，隨機選擇10個高倍鏡視野，計數1000個滑膜細胞，計算陽性細胞百分比，根據染色強度和陽性細胞率的得分乘積進行判斷。按染色強度記分：陽性細胞數≤10%為（-），11%～50%為（+），51%～75%為（++），＞75%為（+++）

1.4 統計學處理

計數資料用陽性率表示，分類變量間的比較用χ2檢驗，相關性分析采用Pearson分析。P＜0.05認為差異具有顯著性。

2 結 果

2.1 RA和OA滑膜組織Ang-2染色

抗Ang-2蛋白多克隆抗體的陽性反應主要定位于細胞漿內，也有一部分細胞漿及細胞核均著色，為棕黃色或棕褐色。染色結果為RA組（34例）：陽性25例（73.53%）；染色強度分別為：9例（-），10例（+），8例（++），7例（+++）；OA組（30例）：陽性10例（33.33%）；染色強度分別為：20例（-），4例（+），5例（++），1例（+++）。兩組染色陽性率及染色強度比較，P均＜0.05，差異有顯著性。

2.2 RA和OA滑膜組織VEGF染色

VEGF的陽性反應主要定位于細胞漿內，為棕黃色或棕褐色顆粒狀，有時可見細胞核呈棕黃色。染色結果為RA組（34例）：陽性29例（85.29%）；染色強度分別為：5例（-），7例（+），12例（++），10例（+++）；OA組（30例）：陽性8例（26.67）；染色強度分別為：22例（-），7例（+），1例（++），0例（+++）。兩組染色陽性率比較，χ2=22.460，P=0.000，差異有非常顯著性。兩組染色強度比較，CMH法，χ2=29.8655，P＜0.001，差異有顯著性。

2.3 Ang-2、VEGF在RA中表達之間的關系

Ang-2、VEGF在RA組織中的表達有顯著相關性。結果見表1。

表1 Ang-2、VEGF在RA中表達之間的關系表

3 討 論

血管內皮生長因子（VEGF）是相對分子質量34-45KD的高度糖基化的堿性蛋白，通過刺激血管新生促進腫瘤生長和轉移，是目前所知作用最強、選擇性最高的內皮細胞絲裂原，是腫瘤血管生成過程中的重要調節因子[1]。Ang-2基因位于染色體8p23.1，編碼496個氨基酸，主要表達于子宮、胎盤等血管生成活躍的器官中[2]，其表達受多種因素的調節，VEGF、表皮生長因子（EGF）和缺氧等可上調Ang-2表達水平[3]。Ang-2在多種惡性腫瘤中Ang-2表達明顯增強[4]，參與腫瘤的血管生成，是腫瘤血管新生的起始及強化因素。

Ang-2對血管新生具有雙重作用[5]，主要與局部環境有關，當局部組織中缺乏VEGF時，Ang-2在細胞內扮演Tie-2拮抗劑的角色，它競爭性抑制Tie-2磷酸化，阻止血管周圍支持細胞的積聚而抑制血管的發生；當局部組織中VEGF含量豐富時，Ang-2抑制Tie-2受體磷酸化，促進血管長度增加和毛細血管前端移動性內皮細胞的增加，促進血管的新生和增生[6]。

Ang-2和VEGF的相互作用在腫瘤組織中的研究較多，兩者在在膠質細胞瘤、乳腺癌、胃癌、食管癌、肝癌、大腸癌中的高表達表明二者在腫瘤血管新生和轉移中發揮了重要的作用[7-8]。

新血管生成被認為是形成和維持RA血管翳的一個重要因素[9]。在腫瘤的一系列研究中，通過靶拮抗Ang-2和VEGF來抑制腫瘤血管形成治療腫瘤提供新的依據[10-12]；血管生成抑制劑也已經成為RA的一種潛在的治療藥物，抑制血管生成的藥物也被證實可有效緩解RA的病情[13]。根據血管翳的多種靶點建立的體外模型，不僅為體外篩選RA治療藥物提供了平臺，也驗證了以血管翳為治療RA靶點的可行性[14,15]。

充分認識滑膜血管或血管翳在RA發病過程中的作用，掌握滑膜血管生成的促進和抑制因素，將為基于滑膜血管翳為靶點的治療提供突破契機。本實驗研究證明了Ang-2和VEGF在RA滑膜中的表達，二者陽性表達位置一致，陽性表達率分別高于OA組，其染色強度明顯也高于對照組，表明Ang-2與VEGF協同作用，促進內皮細胞的增多和血管長度增加，促進血管新生，從而參與RA滑膜增生和血管翳生成的病理過程。隨著研究的進展，在RA中全面治療過程中，阻止包括Ang-2和VEGF在內的細胞因子對RA血管的形成很重要，也是對生成血管的靶點治療之一。

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1671-8194（2013）25-0125-02