吡格列酮對動脈粥樣硬化兔CD40-CD40L系統的影響

李華偉 薛 凌* 高夏青

（盤錦市中心醫院消化二科，遼寧 盤錦 124000）

吡格列酮對動脈粥樣硬化兔CD40-CD40L系統的影響

李華偉 薛 凌* 高夏青

（盤錦市中心醫院消化二科，遼寧 盤錦 124000）

目的 通過觀察吡格列酮對動脈粥樣硬化（AS）兔血脂、sVCAM-1、sICAM-1、sCD40L水平及斑塊/內膜面積比以及斑塊部位炎癥細胞CD40表達的影響，探討吡格列酮與CD40-CD40L系統相互作用機制以及其對兔動脈粥樣硬化的影響。方法 雄性日本大耳白兔，隨機分為4組，每組10只。A組（正常對照組）：普通顆粒飼料喂飼；B組：（高脂模型組）高脂飼料喂飼；C組（高脂模型吡格列酮低劑量組）：高脂飼料喂飼同時給予吡格列酮1mg/（kg·d）灌胃；D組（高脂模型吡格列酮高劑量組）：高脂飼料喂飼同時給予吡格列酮2mg/（kg·d）灌胃，共16周。在飼養開始前及結束后檢測如下指標：①血脂；實驗結束后觀察：②血清hsCRP；③sVCAM-1、sICAM-1、sCD40L；④斑塊/內膜面積比；⑤免疫組織化學法測定斑塊部位巨噬細胞、平滑肌細胞CD40的表達。結果 飼養開始前B、C、D組與A組比較，血脂水平無顯著性差異，16周后，B、C、D組血脂水平與A組比較均顯著升高（P＜0.01）；C、D組血清hsCRP水平顯著低于B組（P＜0.01）；C、D組sVCAM-1、sICAM-1、sCD40L水平顯著降低（P＜0.01）。結論 吡格列酮有抑制動脈粥樣硬化斑塊形成和血管內皮保護功能，而這些功能可能與其阻CD40-CD40L系統有關。

動脈粥樣硬化；吡格列酮；CD40-CD40L系統

動脈粥樣硬化（AS）所致的心腦血管疾病是當今世界的首要死亡原因。粥樣硬化病變是動脈對內膜損傷作出的炎癥-纖維增生性反應的結果，已有研究表明CD40-CD40L系統作用貫穿了AS斑塊發生、發展和破裂的全過程。吡格列酮（PIO）是噻唑烷二酮類（TZDs）藥物，它通過活化PPAR-γ進而抑制各種信號通路的傳導達到抑制炎癥因子基因啟動子激活和轉錄的目的。本研究旨在觀察吡格列酮對CD40-CD40L系統及動脈粥樣硬化兔的影響，并探討其可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑：膽固醇（北京邦定生物制藥有限公司）；sCD40L、sVCAM-1、sICAM-1 試劑盒（七海森雄科技實業有限公司產品）；High-SABC試劑盒（武漢博士得生物工程有限公司）。儀器：全自動生化分析儀；OLYMPUS CH20型光學顯微鏡；CIAS-1000圖像分析儀等。

表1 各組實驗前后TC、TG、LDL-C和HDL-C（mmol/L）在家兔血清的變化（）

表1 各組實驗前后TC、TG、LDL-C和HDL-C（mmol/L）在家兔血清的變化（）

注：與自身0周時相比，#P＜0.05，##P＜0.01；與A組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與B組相比，★P＜0.05，★★P＜0.01

組別TCTGLDL-CHDL-C 0周16周0周16周0周16周0周16周A組1.31±0.331.35±0.251.23±0.510.87±0.210.61±0.320.71±0.110.49±0.120.88±0.12 B組1.35±0.2425.81±11.32##**1.39±0.282.87±1.22#*0.57±0.1914.53±9.82##**0.53±0.276.3±1.5##** C組1.28±0.1219.54±5.5##**0.97±0.141.02±1.83*0.62±0.137.3±2.85##**0.67±0.323.7±1.2##** D組1.29±0.3720.32±10.8##**1.08±0.332.42±1.33#*0.45±0.216.89±2.47##**0.74±0.342.9±1.4##**

1.1.2 動物：健康雄性日本大耳白兔40只，由遼寧醫學院動物實驗中心提供，兔齡3～4個月，體重（2.0±0.15）kg，單籠飼養，適應性喂養1周。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組及模型建立：健康雄性日本大耳白兔40只，隨機分為四組，每組10只。A組（正常對照組）：普通顆粒飼料喂飼；B組：（高脂模型組）高脂飼料喂飼；C組（高脂模型吡格列酮低劑量組）：高脂飼料喂飼同時給予吡格列酮3mg/（kg·d）灌胃；D組（高脂模型吡格列酮高劑量組）：高脂飼料喂飼同時給予吡格列酮6mg/（kg·d）灌胃，自由飲水，連續喂養16周。

1.2.2 標本留取：實驗開始前、結束時（16周末），空腹12h，在兔耳緣靜脈取血用于檢測。于16周末用氣體栓塞法處死動物，無菌操作條件下取出主動脈，置入10%甲醛液固定后，油紅O染色后攝像，AS斑塊最明顯處標本進行石蠟包埋，制作HE染色病理切片及免疫組化病理切片。

1.2.3 血脂檢測：采用酶法測定血清總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）。

1.2.4 血清hsCRP、sVCAM-1、sICAM-1、sCD40L檢測：分別取血清，采用ELISA法的檢測血清hsCRP、sVCAM-1、sICAM-1、sCD40L。

1.2.5 斑塊/內膜面積比：將油紅O染色相片輸入HM IAS22000高清晰度彩色病理圖文分析系統，測量距主動脈弓4cm內主動脈斑塊面積及內膜面積，計算面積比。

1.2.6 免疫組織化學法觀察CD40-CD40L在斑塊及血管內皮的表達：按High-SABC法進行操作，DAB染色，蘇木素復染，胞膜或胞漿出現棕黃色顆粒為陽性；以PBS代替一抗作陰性對照。在10×40倍顯微鏡下，每張切片隨機取10 個視野，細胞無特異性染色（呈淺藍）為“-”，輕度特異性染色即弱陽性（淺黃色）為“+”，中度特異性染色即陽性（棕黃色）為“++”，明顯特異性染色即強陽性（深棕色或黑色）為“+++”。

2 結 果

2.1 血脂檢測

實驗前各組血脂均無顯著性差異。16周末，B、C、D組與A組相比，TC、TG、HDL-C和LDL-C均顯著升高（P＜0.01），結果見表1。

表2 血清hsCRP（mg/L）、sVCAM-1、sICAM-1、sCD40L（ng/L）指標檢測結果（）

表2 血清hsCRP（mg/L）、sVCAM-1、sICAM-1、sCD40L（ng/L）指標檢測結果（）

注：與B組相比，★★P＜0.01

組別hsCRPsVCAM-1sICAM-1sCD40L A組0.407±0.3041.23±0.2635.42±4.330.49±0.13 B組1.532±0.1835.32±0.48116.54±23.757.93±1.65 C組1.402±0.152★★4.36±0.82★★82.74±13.69★★3.41±0.82★★D組1.205±0.145★★4.05±0.93★★0.33±14.72★★2.98±0.44★★

2.2 血清hsCRP、sVCAM-1、sICAM-1、sCD40L檢測

16周末時，C、D組血清hsCRP水平顯著低于B組（P＜0.01）；C、D組sVCAM-1、sICAM-1、sCD40L水平顯著降低（P＜0.01），結果見表2。

3 討 論

AS是一種多因素作用的慢性炎癥性疾病，近年研究表明CD40廣泛表達于AS斑塊內的巨噬細胞、平滑肌細胞、T細胞等，其作用幾乎貫穿了AS斑塊發生、發展和破裂的全過程，抑制CD40在炎癥細胞的表達可能會在AS防治中起到重要作用。吡格列酮是PPAR-γ激動劑，PPAR-γ激活后抑制超氧離子的產生及與氧化還原敏感的轉錄因子如NF--kappaB等相關的核轉錄因子[1,2]，進而抑制炎癥因子靶基因的活化與轉錄。ICAM-1和VCAM-1是介導細胞與細胞、細胞與細胞外基質間黏附作用的膜表面糖蛋白，它由CD40-CD40L系統誘導產生，并且與動脈粥樣硬化斑塊發生發展密切相關[3]。本實驗結果顯示，與單純高脂飼料喂養相比，吡格列酮灌胃組兔sCD40L水平顯著降低，相應的sVCAM-1、sICAM-1水平也顯著降低。免疫組織化學法定位顯示CD40、CD40L在斑塊部位炎癥細胞上表達顯著減少，同時HE染色切片觀察發現，吡格列酮組兔主動脈內膜病理改變與模型組相比顯著減輕[4-6]。這說明，吡格列酮可以抑制動脈粥樣斑塊形成，保護血管內皮，而這些作用的可能機制是它抑制了動脈粥樣硬化發展過程中CD40-CD40L在炎癥細胞的表達。本實驗研究探討吡格列酮阻斷CD40-CD40L系統干預AS的發生發展，為AS臨床治療 提供新的靶點，同時擴展吡格列酮在臨床上的應用，為臨床防治動脈硬化提供新的思路。

[1] Huang JV,Greyson CR,Schwartz GG.PPAR-γ as a Therapeutic Target in Cardiovascular Disease:Evidence and Uncertainty[J].J Lipid Res,2012,53(9):1738-1754.

[2] Barbieri M,Filippo CD,Esposito A.Effects of PPARs Agonists on Cardiac Metabolism in Littermate and Cardiomyocyte-Specific PPAR-cγ- Knockout (CM-PGKO) Mice[J].PLoS ONE April, 2012,7(4):e35999.

[3] Zhao LQ,Wei RL,Cheng JW,et al.The expression of intercellular adhesion molecule-1 induced by CD40-CD40L ligand signaling in orbital fibroblasts in patients with Graves' ophthalmopathy[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci,2010,51(9):4652-4660.

[4] Ogasawara D,Shite J,Shinke T,et al.Pioglitazone reduces the necrotic-core component in coronary plaque in association with enhanced plasma adiponectin in patients with type 2 diabetes mellitus[J].Circ J,2009;73(2):343-351.

[5] Ye Y,Hu Z,Lin Y,et al.Downregulation of microRNA-29 by antisense inhibitors and a PPAR-gamma agonist protects against myocardial ischaemia-reperfusion injury[J].Cardiovasc Res,2010, 87(3):535-544.

[6] Kobayashi D,Takamura M,Murai H,et al.Effect of pioglitazone on muscle sympathetic nerve activity in type 2 diabetes mellitus with alpha-glucosidase inhibitor[J].Auton Neurosci,2010,158(1-2): 86-91.

R541.4

B

1671-8194（2013）25-0074-02

*通訊作者：E-mail:lysyxueling@163.com