死亡相關蛋白激酶1基因啟動子甲基化在宮頸癌中的臨床意義

李 琦，胡昌華，萬光華，張 婧（.湖北省武漢市武漢科技大學附屬漢陽醫院婦產科 430050；2.湖北省襄陽市中心醫院婦產科 4402）

宮頸癌的發病機制主要與基因表達改變有關，表觀遺傳學在其發病機制中扮演重要角色，其中抑癌基因啟動子甲基化引起的表觀遺傳學改變被認為是最重要的發病機制［1－2］。死亡相關蛋白激酶1（DAPK1）為鈣調蛋白調節的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可正性調控細胞凋亡，與腫瘤的發生、發展和轉移密切相關，在腫瘤中普遍存在高甲基化狀態［3－4］。本研究采用甲基化特異性聚合酶鏈反應（PCR）檢測宮頸癌組織和癌旁組織

DAPK1基因啟動子甲基化狀態，研究DAPK1基因在宮頸癌診斷、病情和預后評估中的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 研究對象為2010年1月至2012年1月手術治療的80例初治宮頸癌患者，均經癥狀體征、體格檢查、影像學及病理組織學檢查確診。年齡30～85歲，平均（50.6±15.4）歲；病理組織類型包括鱗狀細胞癌60例，腺癌12例，腺鱗癌8例；根據2009年國際婦產科聯盟（FIGO）宮頸癌分期，其中Ⅰ期20，Ⅱ期35例，Ⅲ17例，Ⅳ期8例。

1.2 方法 檢測標本均取宮頸癌患者手術切除腫瘤組織和距腫瘤組織大于5cm癌旁組織，標本取材后立即置于液氮中保存。DNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司。引物由大連寶生物工程有限公司合成。甲基化修飾試劑盒購于北京天漠公司。DAPK1基因啟動子甲基化MSP檢測，按基因組DNA試劑盒說明書進行，提取宮頸癌組織和癌旁正常組織總DNA。按甲基化試劑盒說明書采用重亞硫酸鹽將提取的DNA未甲基化C轉化為U，轉化后的樣本進行PCR擴增。引物采用Methyl Primer Express V1.0設計，序列見表1，PCR反應體系為25μL，循環條件為：95℃預變性10min，95℃變性1min，65℃退火45s，72℃延伸45s，共35個循環，最后一輪72℃延伸10min。擴增后的產物經瓊脂糖凝膠電泳后檢測。

表1 RASSF1A基因MSP甲基化引物

1.3 統計學方法 采用Sigmaplot 11.0統計軟件進行數據處理及統計學分析。計數數據采用χ2檢驗或Fisher精確計算P值。檢驗水準α＝0.05，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 宮頸癌組織和癌旁組織檢測結果 80例患者中宮頸癌組織有50例DAPK1基因啟動子呈甲基化狀態，甲基化率為62.5%，癌旁組織中有4例DAPK1基因啟動子呈甲基化狀態，甲基化率為5.0%，宮頸癌組織中DAPK1基因啟動子甲基化率顯著高于宮頸癌癌旁組織，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖1。

圖1 RASSF1A基因啟動子甲基化MSP結果

2.2 DAPK1基因啟動子甲基化與臨床病理因素的關系 見表2。宮頸癌癌組織DAPK1基因啟動子甲基化率在年齡和病理中差異無統計學意義（P＞0.05），在組織學分級、腫瘤最大徑、淋巴結轉移、器官轉移、FIGO分期中差異均有統計學意義（P＜0.05），組織學分級高、腫瘤最大徑大、有淋巴結轉移及器官轉移、FIGO分期晚的癌組織DAPK1基因啟動子甲基化率高于組織學分級低、腫瘤最大徑小、無淋巴結轉移及器官轉移、FIGO分期早的癌組織。

表2 DAPK1基因啟動子甲基化與臨床病理因素的關系

3 討 論

基因甲基化是最重要的表觀遺傳學調控機制，真核生物的DNA中高達80%的CpG位點發生甲基化改變，這些甲基化主要分布在基因啟動子區域的CpG島，CpG位點的甲基化可引起染色體及DNA空間構象發生改變，主動或被動阻遏轉錄因子結合到轉錄起始點而調控基因表達［5］。研究表明，基因啟動子甲基化與腫瘤的發病機制、病情及預后緊密相關，可作為腫瘤的基因水平生物學標志物，較傳統的蛋白水平的腫瘤標志物具有更高的靈敏度及特異性［6］。DAPK1作為新發現的抑癌基因，具有鈣調蛋白調節的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的作用，可正性調控細胞的凋亡，在各種細胞凋亡系統中扮演重要角色，被證實與腫瘤的發生、發展和轉移緊密相關，其啟動子高甲基化改變在乳腺癌及消化系統均可檢測到［7－8］，在人乳頭瘤病毒誘導發生的宮頸癌組織中其甲基化高達56.3%［9］。本研究中，宮頸癌組織中DAPK1基因啟動子甲基化率為62.5%，癌旁組織中甲基化率為5.0%，宮頸癌組織中DAPK1基因啟動子甲基化率顯著高于宮頸癌癌旁組織，差異有統計學意義（P＜0.05），由此證實DAPK1基因在宮頸癌中存在高甲基化狀態。

研究表明，抑癌基因的表觀遺傳學改變在腫瘤的診斷、病情評估和預后評估中扮演重要角色，越來越多的基因被發現在腫瘤診斷中表現出極高的靈敏度及特異性。在本研究中，組織學分級高、腫瘤最大徑大、有淋巴結轉移及器官轉移、FIGO分期晚的宮頸癌組DAPK1基因啟動子甲基化率高于組織學分級低、腫瘤最大徑小、無淋巴結轉移及器官轉移、FIGO分期早的癌組織，提示DAPK1基因啟動子甲基化在宮頸癌病情及預后評估中具有重要作用。腫瘤的組織學分級及分期是公認的與腫瘤病情及預后相關的因素，分化程度越低、分期越晚，患者病情越重，預后越差，生存時間越短，質量越差，基于這個事實，本文認為DAPK1基因啟動子甲基化可以作為宮頸癌基因水平的生物學標志物，可為宮頸癌的診斷、病情與預后評估提供證據，盡管較目前的蛋白質生物學標志物的檢測繁瑣，隨著檢測水平的提高，會越來越體現出高靈敏度及特異性等優點。

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