中醫(yī)解毒法優(yōu)化干預(yù)對BALB/c結(jié)腸癌小鼠CEA、sCD44的實驗研究

阮善明 沈敏鶴 王 益 林 紅 鄭麗萍 李夢婷 張 愷

(1 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤中心，杭州，310006;2 浙江中醫(yī)藥大學(xué)，杭州，310053)

本研究解毒法的代表方劑解毒三根湯源于本院70年代初期創(chuàng)制的解毒抗癌驗方三根糖漿，其主要組成為虎杖根、藤梨根、水楊梅根，臨床實踐已經(jīng)證明解毒三根湯治療消化道腫瘤的有效性;同時以消化道一線化療藥5－FU 作為化療法的代表［1－2］。本實驗通過建立CT－26結(jié)腸癌細胞小鼠移植瘤模型，以解毒三根湯聯(lián)合傳統(tǒng)化療藥5－FU 從不同階段干預(yù)實驗?zāi)Ｐ停砸至雎省Ⅲw重等為主要觀察目的，評價中醫(yī)解毒法聯(lián)合化療的優(yōu)化治療模式。同時，通過ELISA 法檢測血清CEA、sCD44 含量，進一步探討其治療結(jié)腸癌的可能作用機制，現(xiàn)結(jié)果報道如下。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗細胞 CT26結(jié)腸癌細胞系由浙江中醫(yī)藥大學(xué)提供。

1.1.2 實驗動物 SPF 級健康BALB/C 小鼠，60只，體重(18±2)g，6～8周齡，雄性。購自浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。

1.1.3 實驗藥品 氟尿嘧啶粉劑購自上海源葉生物科技有限公司。解毒三根湯(藤梨根30 g、虎杖根30 g、水楊梅根30 g)，購自浙江省中醫(yī)院中藥房，按照原方比例配置成解毒法湯煎劑，過濾濃縮后每毫升含生藥1.2 g。(藤梨根:產(chǎn)地浙江，批號:20101117;水楊梅根:產(chǎn)地浙江，批號:20101210;虎杖根:產(chǎn)地浙江，批號:20090302)。解毒三根湯水煎劑的制備:由生藥材藤梨根500 g，水楊梅根500 g，虎杖根500 g，共1500 g。先用10 倍生藥重量的蒸餾水浸泡半小時，武火煎沸后改文火煎半小時，用8 層紗布過濾取出藥汁，再加入8倍水，文火煎半小時，過濾取汁，收集兩次煎劑，棄去藥渣，文火濃縮成1.2 g/mL，分裝至無菌玻璃瓶內(nèi)，并沸水浴內(nèi)煮半小時，冷卻后4℃冰箱冷藏。

1.1.4 實驗主要試劑 胎牛血清(FBS):Gibco 公司;RPMI Medium 1640:Gibco 公司;PBS:杭州科易生物技術(shù)有限公司;胰蛋白酶(0.25%胰酶+0.02%EDTA):杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司;二甲基亞砜(DMSO):Amersco 公司;小鼠CEA ELISA 試劑盒:杭州達文生物科技有限公司，R＆D 公司進口分裝;小鼠sCD44 ELISA 試劑盒:杭州達文生物科技有限公司，R＆D 公司進口分裝。

1.1.5 實驗儀器 自動平衡離心機LDZ5－2:北京醫(yī)用離心機廠;5%CO2培養(yǎng)箱HEPA class100:Thermo 公司;倒置顯微鏡:Olympus 公司;生物安全柜:Thermo 公司;電熱恒溫水浴器DK－S24型:上海森信公司;電子天平:浙江凱豐集團有限公司;液氮儲存罐:Thermo 公司;超低溫冰箱:日本SANYO 公司;移液器:Eppendrof公司。

1.1.6 試劑配制 工作溶液的配制:將50 體積BCA Reagent 與1 體積Cu Reagent 混合即為WR 工作試劑，呈嫩綠色;室溫1周內(nèi)穩(wěn)定。標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液配制:用PBS 與待測蛋白樣品匹配之緩沖液進行倍比稀釋:20μL 4 000μg/mL BSA+30μL 稀釋溶液(PBS)=50μL(BSA=1 600μg/mL)，從中取25μL 連續(xù)倍比稀釋，得到BSA 標(biāo)準(zhǔn)溶液1 600、800、400、200、100、50、25、0(僅PBS)μg/mL，各25μL。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物選擇與分組 健康BALB/C 小鼠60只，體重18±2 g，雄性，稱重后隨機分成5組移植瘤模型:提前干預(yù)組、延后干預(yù)組、單純中藥組、單純化療組、模型對照組以及1組陰性對照組，每組10只。各組小鼠分籠飼養(yǎng)，每籠5只。治療期間定期監(jiān)測體重及瘤體變化。

1.2.2 動物造模 將小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，正常飲食。取50只小鼠右腋皮下接種CT26結(jié)腸癌細胞建立移植瘤模型。取CT26結(jié)腸癌細胞株復(fù)蘇后培養(yǎng)傳代，收集對數(shù)生長期細胞，以生理鹽水調(diào)整細胞濃度至1×107/mL，每鼠接種0.2 mL 于右側(cè)腋下皮下。

1.2.3 動物給藥 接種當(dāng)天記為第0 d，提前干預(yù)組:接種后第1～7 d 中藥灌胃，第8～14 d 予5－FU 腹腔注射。延后干預(yù)組:于接種第8～14 d 予5－FU 腹腔注射，第15～21 d 中藥灌胃。單純化療組:于接種第8～14 d 予5－FU 腹腔注射。單純中藥組:于接種第8～14 d 予中藥灌胃。模型對照組:于接種第8～14 d予生理鹽水灌胃。陰性對照組:不作任何處理。中藥灌胃按解毒三根湯擬定劑量水煎劑定時灌胃，濃度1.2 g/mL，劑量0.2 mL/(10g·d)，每日1次。5－FU腹腔注射用0.9% 生理鹽水稀釋成1.5 mg/mL，0.1 mL/(10g·d)，每日1次。

1.2.4 血清收集方法 實驗第22 d，制備標(biāo)本的60只小鼠末次灌胃(禁食不禁水12 h)4 h，摘眼球取血，常溫靜置15～30 min 后低溫離心(3 000 r/min，15 min)，超凈臺上用移液槍取上層血清，－20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 小鼠取瘤 將摘眼球取血后的荷瘤小鼠置于冰上迅速剝除右腋皮下瘤體，生理鹽水沖洗后，一半用10%福爾馬林固定，用做免疫組化，另一半放入凍存管暫時保存于液氮中，然后移至－70℃冰箱凍存標(biāo)本。

1.2.6 細胞培養(yǎng) 選用CT26結(jié)腸癌細胞株，使用添加10%胎牛血清的GIBCO 公司的RPMI－1640 培養(yǎng)液，培養(yǎng)于含5%CO2的飽和濕度、37℃恒溫培養(yǎng)箱中。所有細胞每2 d 以1:3 傳代。

1.2.7 觀察指標(biāo)與檢測方法 抑瘤率的計算:1)腫瘤體積(Volume)=a×b2/2(a 為長徑，b 為短徑)，體積抑瘤率(%)=1－(受試藥物組平均體積÷模型對照組平均體積)×100%。2)質(zhì)量抑瘤率(%)=1－(受試藥物組平均瘤重÷ 模型對照組平均瘤重)×100%。ELISA 測定血清CEA、sCD44的含量。

2 結(jié)果

2.1 腋下接種CT26 細胞的BALB/c 小鼠移植瘤模型實驗結(jié)果 課題組建立的是BALB/c 小鼠腋下接種CT26的小鼠移植瘤動物模型。當(dāng)接種到BALB/c 小鼠右腋皮下時，發(fā)現(xiàn)100%成瘤，而且生長速度快，右腋皮下接種CT－26 細胞5天后，開始可以觸及到米粒大小的腫塊，7 d 后腫瘤長至0.5 cm3大小，造模成功。

2.2 各組小鼠的體重變化情況的觀察結(jié)果 按照7 d為1個治療階段，取每一階段的1、3、5、7 d 稱取小鼠體重。

體重變化:圖1 顯示的是各組小鼠自造模成功之日起至實驗結(jié)束時體重變化曲線。用藥前小鼠總體體重為(18.46±1.04)g，組間無差異。治療結(jié)束后，各組體重由高到低依次為:單純中藥組、模型對照組、提前干預(yù)組、延后干預(yù)組、單純化療組。提前干預(yù)組和單純中藥組跟模型對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);延后干預(yù)組、單純化療組與模型對照組相比體重下降明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。去瘤體重變化:圖2 清晰顯示了各組小鼠治療前后的去瘤體重變化。圖中顯示:提前干預(yù)組和單純中藥組在治療后體重有所上升，和模型對照組的去瘤體重相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，延后干預(yù)組體重變化相差不明顯。

圖1 各組小鼠于造模過程中的體重變化()(單位:g)

表1 各組治療后體質(zhì)量比較()(單位:g)

表1 各組治療后體質(zhì)量比較()(單位:g)

注:與模型對照組相比，* P＜0.05。

圖2 各組小鼠治療前后的去瘤體重變化()(單位:g)

2.3 實驗小鼠瘤體變化以及抑瘤率觀察結(jié)果 各組小鼠皮下接種細胞5 d 后，腫瘤開始可以觸及，1周后可以被游標(biāo)卡尺測量。分別取第二、第三階段的1、3、5、7 d 測量腫瘤的長徑以及短徑，根據(jù)公式計算瘤體體積。

瘤體體積變化:小鼠瘤體體積從可以被測量起組間無統(tǒng)計學(xué)意義。治療結(jié)束時，各治療組的移植瘤從大到小依次為:模型對照組、單純中藥組、單純化療組、延后干預(yù)組、提前干預(yù)組。單藥化療組、單純中藥組與模型對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);而兩藥合用組的抑制效果更好，提前干預(yù)組、延后干預(yù)組與模型對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)。

圖3 各組小鼠于造模過程中的體積變化()(單位:mm3)

治療各組瘤體體積抑制率以及質(zhì)量抑制率結(jié)果:治療組的體積抑瘤率和質(zhì)量抑制率表現(xiàn)出一致性，從高到低分別為提前干預(yù)組、延后干預(yù)組、單純化療組、單純中藥組。

表2 各組小鼠于造模過程中的瘤體體積變化()，(單位:mm3)

表2 各組小鼠于造模過程中的瘤體體積變化()，(單位:mm3)

注:與提前干預(yù)組相比，▼P＜0.05;與模型對照組相比，◇P＜0.05;與模型對照組相比，▽P＜0.05;與模型對照組相比，#P＜0.05;與模型對照組相比，* P＜0.05;與模型對照組相比，☆P＜0.05。

表3 各組小鼠體積和質(zhì)量抑瘤率

圖4 各組小鼠體積抑瘤率和質(zhì)量抑瘤率

表4 各組小鼠血清CEA、CD44 水平情況的比較()(單位:ng/mL)

表4 各組小鼠血清CEA、CD44 水平情況的比較()(單位:ng/mL)

注:與模型對照組相比，▲P＜0.05;與模型對照組相比，■P＜0.05;與陰性對照組相比，●P＜0.05;與陰性對照組相比，□P＜0.05。

2.4 實驗小鼠血清CEA及sCD44 指標(biāo)的變化 實驗結(jié)果顯示，治療各組血清CEA 含量均高于陰性對照組，低于模型對照組。提前干預(yù)組、延后干預(yù)組、單純化療組與模型組相比較，CEA 水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，單純中藥組和模型對照組之間無統(tǒng)計學(xué)意義。同時，實驗各組的血清sCD44 含量均高于空白組，低于模型對照組。以提前干預(yù)組、延后干預(yù)組最低，其次是單純中藥組，再次為單純化療組，其中提前干預(yù)組、延后干預(yù)組、單純化療組與模型對照組相比較，sCD44 水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。單純中藥組和模型對照組之間無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖5 各組小鼠血清CEA、sCD44 水平

3 討論

近年來化療藥物與植物藥聯(lián)用增強其抗腫瘤效果成為研究者關(guān)注的熱點［3－5］，但是目前國內(nèi)外對中醫(yī)藥在化療期間介入時機的選擇中，尚未有明確的規(guī)范化方案［6－7］。本課題在治療期間通過對小鼠體重的觀察發(fā)現(xiàn)，提前干預(yù)組和模型對照組的體重差異出現(xiàn)最早，結(jié)合瘤體體積變化，得出該體重差異的出現(xiàn)得益于提前干預(yù)組瘤體生長相對緩慢。同時對治療前后小鼠的去瘤體重變化進行觀察，結(jié)果顯示:提前干預(yù)組以及單純中藥干預(yù)組能增加治療后小鼠去瘤體重，且和模型對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。而延后干預(yù)組與單純化療組治療后小鼠體重均有不同程度下降。解毒類中藥提前干預(yù)能緩解化療帶來的毒副反應(yīng)，緩解化療對體重的負面影響。單純解毒類中藥干預(yù)小鼠，也能使小鼠體重增加，說明解毒類中藥在機體未出現(xiàn)惡病質(zhì)的情況下能有效延緩疾病的進程，緩解惡化，這可能與抑制腫瘤活性，減少腫瘤消耗有關(guān)。在對瘤體生長情況的觀察中發(fā)現(xiàn)，小鼠瘤體體積治療前無統(tǒng)計學(xué)意義，從第8天起提前組與模型組首先出現(xiàn)差異，并且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。說明解毒三根湯能延緩小鼠瘤體生長速度。此后各組與模型組的瘤體體積差異逐漸明顯。在用藥期間，兩藥合用組顯示了比單藥處理組更小的瘤體變化幅度;而在兩藥合用組中，又以提前組顯示出了良好的腫瘤抑制作用。這可能與中藥的增加化療敏感性、較少早期荷瘤有關(guān)。綜上所述，化療前應(yīng)用解毒法或者當(dāng)化療未實施的情況下單獨使用解毒法不僅能改善生活質(zhì)量，延緩腫瘤生長速度，更能延長總生存期。化療后應(yīng)用解毒法未能在生活質(zhì)量以及生存期上獲得明顯收益。

CD44 是分布極廣泛的細胞表面跨膜糖蛋白，是細胞外的基質(zhì)－透明質(zhì)酸的主要受體，參與細胞與細胞之間及細胞與基質(zhì)之間的黏附［8］。高表達CD44分子的腫瘤細胞通過與細胞外基質(zhì)中透明質(zhì)酸、血管內(nèi)皮細胞的黏著，賦予腫瘤細胞很強的侵襲轉(zhuǎn)移能力［9－11］。血清中可溶性CD44(sCD44)來源于細胞表面CD44 胞外段的脫落，其機制可能是內(nèi)生蛋白酶的作用［12］。本實驗研究表明，經(jīng)解毒三根湯和5－FU 治療的小鼠血清sCD44 水平均有不同程度降低，而又以兩藥合用組其下降幅度最大。

癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)是公認的消化道惡性腫瘤早期診斷的靈敏指標(biāo)，同時也是觀察消化道惡性腫瘤手術(shù)及放化療效果的有用指標(biāo)，已經(jīng)在臨床上廣泛應(yīng)用［13－15］。本實驗發(fā)現(xiàn)各治療組的CEA 水平均有不同程度下降，尤其以兩藥和用組明顯，其效果好于單藥疊加，說明中藥與化療藥有協(xié)同降腫瘤標(biāo)記物作用，間接提示兩藥合用能減少侵襲轉(zhuǎn)移，提高預(yù)后。

本實驗通過建立CT－26結(jié)腸癌細胞Balb/c 小鼠皮下接種模型，探索中醫(yī)解毒法協(xié)同化療治療結(jié)腸癌小鼠的優(yōu)化模式，設(shè)立兩個優(yōu)化治療組解毒法提前干預(yù)組和延后干預(yù)組，同時設(shè)立單純解毒法治療組、單純化療治療組和模型對照組，以及陰性對照組。觀察解毒法優(yōu)化治療模式對小鼠體重、腫瘤病灶的影響，并對可能的作用機制進行研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)提前干預(yù)組和單純中藥組能明顯增加小鼠體重，解毒法聯(lián)合化療能明顯縮小病灶。同時發(fā)現(xiàn)中醫(yī)解毒法協(xié)同化療能下調(diào)血清sCD44 表達，表明解毒法聯(lián)合化療在縮小病灶上的獲益與促進腫瘤細胞凋亡、抑制增殖、抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。

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