復方阿膠漿對小鼠lewis 肺癌CyclinD1、CD44 表達的影響

孫敘敏 陳信義

(1 煤炭總醫院中醫科，北京，100028;2 北京中醫藥大學東直門醫院腫瘤血液科，北京，100700)

研究發現，周期素D1(Cyclin D1)的過度表達在許多惡性腫瘤的發生、發展中起著重要的作用［1－5］，下調Cyclin D1的表達進而影響腫瘤細胞G1/S的過渡在一定程度上可以抑制增殖，延緩進展［6－7］，并增強腫瘤細胞對藥物的敏感性［8］。CD44 屬于黏附分子家族成員之一，目前研究主要致力于CD44 與惡性腫瘤臨床病理特點的關系上，研究結果尚不統一［9］，多數研究認為CD44的過度表達參與了惡性腫瘤的發生、轉移，推測其可能成為惡性腫瘤的不良預后因子。本研究采用免疫組化技術，集中觀察經典古方宋“兩儀膏”改制成的復方制劑復方阿膠漿對Cyclin D1、CD44 表達的影響，古方新用，從抗腫瘤機制方面探索復方阿膠漿的臨床應用。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性C57BL/6 小鼠108只，清潔級，體重15～18 g，購于中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心［許可證號:SCXK(軍)2007－004］，于中國醫學科學院腫瘤研究所SPF 級動物室飼養。Lewis 肺癌(Lewis Lung carcinoma LLC)瘤源由中國醫學科學院腫瘤研究所提供。復方阿膠漿(阿膠、黨參、人參、熟地黃、山楂)，20 mL/支，山東東阿阿膠股份有限公司制備并提供(批號:091146);注射用環磷酰胺(CTX)，200 mg/支，山西普德藥業有限公司，國藥準字H14023686。兔抗CD44(批號:BA0321)一抗、兔鏈霉菌抗生物素蛋白－過氧化物酶(SP)試劑盒SP900l、DAB 顯色劑(批號:AR1022)均購自武漢博士德公司、兔抗CyclinD1(批號:bs－0623R)一抗購自北京博奧森生物技術有限公司。Olympus 公司IMT－2 倒置顯微鏡;美國Diagnostic Instrument Inc Spot－II 數碼成像系統。

1.2 方法

1.2.1 造模及分組 荷lewis 肺癌的C57BL/6 小鼠脫頸處死，完整剝離瘤塊，以生理鹽水研磨，調細胞密度約2×107/mL(臺盼藍計數活細胞＞90%)，每只小鼠右腋皮下接種0.2 mL。接種后第3日，按體重隨機分為6組，分別為模型對照組、CTX組、復方阿膠漿組(中劑量)、復方阿膠漿(大、中、小劑量)聯合CTX組，每組10只，稱體重并編號［10］。

1.2.2 給藥方法 模型對照組予生理鹽水0.4 mL，連續灌胃12 d;CTX組，隔日腹腔注射0.2 mL，共給藥6 d(CTX 給藥劑量為35 mg/kg);復方阿膠漿組(即中劑量組)，予復方阿膠漿原液0.2 mL +生理鹽水0.2 mL 灌胃12 d;復方阿膠漿大、中、小劑量聯合CTX組分別予復方阿膠漿原液0.4 mL、復方阿膠漿原液0.2 mL+生理鹽水0.2 mL、復方阿膠漿0.1 mL +生理鹽水0.3 mL 灌胃12 d(復方阿膠漿臨床常規用量為60 mL/d，即每20 mL 該液體中含阿膠3 g)，其中CTX 給藥方式及劑量同CTX組。以上給藥劑量均按照人鼠體表面積折算，復方阿膠漿中劑量為成人劑量的9 倍。

1.2.3 觀察指標 1)移植瘤CyclinD1、CD44 免疫組化檢測:末次給藥24 h 后處死小鼠，取各組腫瘤組織標本，用10 %甲醛在4℃下固定48 h，經脫水、透明、浸蠟及包埋制成蠟塊。每組選8個蠟塊，按5μm 厚度連續切片，固定于防脫玻片。染色步驟參照SP 法試劑盒，CyclinD1的稀釋濃度為1∶20;CD44的稀釋濃度為1∶25。以PBS 代替一抗作為陰性對照，以已知的陽性切片為陽性對照。在光鏡下觀察陽性反應呈團塊狀或灶狀的棕黃色或褐色。封片后以美國Diagnostic Instrument Inc Spot－Ⅱ數碼成相系統拍照，觀察蛋白表達。以Universal Imaging Corporation Meta Morph分析系統對結果進行半定量分析，每張片子取5個視野，在400(40×10)倍顯微鏡下，設置統一閾值分析陽性信號的平均光密度(AOD)，以5個視野的平均值作為該片的數據。2)觀察生存期:同期飼養48只C57BL/6 荷lewis 肺癌小鼠，每組8只，觀察2個月，造模、分組及給藥方法同上。以此來大體判斷給藥各組的預后情況。

2 結果

2.1 對瘤組織Cyclin D1、CD44 表達的影響及兩指標之間相關性

2.1.1 各組對瘤組織Cyclin D1 表達的影響 復方阿膠漿組、復方阿膠漿大劑量聯合CTX組能明顯下調CyclinD1的表達水平，AOD值分別為(0.213 3±0.020 4)、(0.223 0±0.020 1)，與模型組比較(0.260 9±0.027 2)，有統計學意義(P＜0.05);聯合用藥各組與單用CTX組比較無統計學意義(P＞0.05)。見表1，各組CyclinD1 染色情況見圖1A－F。

圖1 實驗各組瘤組織CyclinD1 表達情況(SP×400)

表1 復方阿膠漿對LLC組織CyclinD1、CD44 表達的影響(，n=8)

表1 復方阿膠漿對LLC組織CyclinD1、CD44 表達的影響(，n=8)

注:與模型對照組相比，* P＜0.05。

2.1.2 各組對瘤組織CD44 表達的影響 復方阿膠漿組、CTX組、復方阿膠漿大、中劑量聯合CTX組能下調CD44的表達，AOD值分別為(0.195 9±0.014 0、0.191 9±0.022 5、0.191 1±0.022 4、0.184 3±0.024 8)，與模型組比較(0.225 0±0.027 4)有統計學意義(P＜0.05);聯合用藥各組與單用CTX組比較無統計學意義(P＞0.05)，見表1，各組CD44 染色情況見圖2A－F。

2.1.3 瘤組織CyclinD1 與CD44 線性相關性 經直線相關性檢驗，CyclinD1 與CD44 二者相關系數為r=0.232 21(P＞0.05)，表示二者之間無明顯線性相關關系，見表2。

表2 六組LLC組織的CyclinD1 與CD44的相關性()

表2 六組LLC組織的CyclinD1 與CD44的相關性()

圖2 實驗各組CD44 表達情況(SP×400)

2.2 復方阿膠漿對各組小鼠生存期的影響 實驗證明，復方阿膠漿組的生存時間最長，約(27.3±6.9)d;模型對照組的生存時間最短，約(17.6±4.3)d，二者經t 檢驗，差異有統計學意義(P＜0.01)。經Kaplan－Meier 法生存分析，各組間均無統計學意義(P＞0.05)，見表3。

表3 復方阿膠漿對荷lewis 肺癌鼠生存期的影響(，n=8)

表3 復方阿膠漿對荷lewis 肺癌鼠生存期的影響(，n=8)

注:與模型組比，＊＊P＜0.01。

3 討論

3.1 Cyclin D1的表達與肺癌的關系 Cyclin D1 是G1/S 期過渡的重要調控因子，可刺激周期蛋白依賴性激酶4(CDK4)介導Rb 基因蛋白產物的磷酸化，使Rb基因對細胞生長的抑制效應失活，從而使細胞周期進入DNA 合成期，病理狀態下即可使細胞轉化成腫瘤細胞。大多數學者認為Cyclin D1 單獨或與另外的癌基因編碼產物共同參與肺癌的發生。如賀駿等人對包括肺癌在內的多種腫瘤研究發現，正常組織中不表達或者低表達Cyclin D1，而在肺癌組織中表達率高達56.8%，明顯高于正常組織，即提示了Cyclin D1 在肺癌形成中可能起了至關重要的作用［11］。劉潔等人對女性肺腺癌患者研究發現Cyclin D1 表達高者，腫塊形成大，亦提示了肺腺癌的形成與Cyclin D1的高表達有關［12］。進一步多個小樣本研究發現Cyclin D1 蛋白的表達與肺癌患者吸煙與否、腫瘤大小、疾病分期相關，與分化程度、淋巴結轉移情況關系不確切，吸煙、腫塊大、分期晚者，Cyclin D1 表達陽性率高，并可能是Ⅰ期非小細胞肺癌患者極有意義的預后因子［13－16］。Cyclin D1 蛋白表達對肺癌患者的危險分層、病情評估、預后有一定的臨床應用價值。

近年來在干預Cyclin D1 表達進而防治肺癌的研究中我們發現中藥制劑越來越多，如消積飲可能通過降低小鼠lewis 肺癌細胞Cyclin D1的表達從而抑制lewis 肺癌生長［17］;肺抑瘤合劑配合化療能有效抑制腫瘤細胞Cyclin D1、p53的表達，進而發揮其抗腫瘤作用［6］。有一項研究初步顯示了中藥在干預CyclinD1中不同于西藥的優勢所在，雙黃升白顆粒對骨髓抑制Lewis 肺癌荷瘤小鼠的細胞周期具有雙重調控作用，能夠上調骨髓CDK4、CDK6、CyclinD1 表達、下調腫瘤組織CDK4、CDK6、CyclinD1 表達［18］，從而在發揮抗腫瘤效應的同時，又能促進骨髓造血功能，即有減毒性。

3.2 CD44的表達與肺癌的關系 CD44 是黏附分子家族的一員，有多種亞型，介導黏附，參與淋巴細胞的歸巢和活化，參與信號轉導、參與造血等，發揮著廣泛的生物學效應，近年來已經發現它在惡性腫瘤的發生發展中也起到了重要的作用，尤其是對腫瘤的侵襲、轉移與預后。既往研究對CD44 基因在肺癌中的表達情況報道結果不一，甚至相反。近兩年國內研究普遍認為，CD44 與肺癌的組織學類型、分化程度、淋巴結轉移及生存時間相關，而與年齡、腫瘤大小、性別、TNM分期無關［19－22］，用到的實驗方法多數為免疫組化，少數用到RT－PCR。目前有關拮抗CD44、下調其表達水平的試驗藥品比較鮮見，如有學者研究益肺清化膏的抗癌機制時發現其可下調CD44、CD44v6的表達水平，推測該藥可能通過減弱腫瘤細胞與血管內皮ECM 間的異質黏附，降低腫瘤向基質的侵襲，而達成抗腫瘤的目標［23］。張培彤等人采用流式細胞計數法研究了蘇木及聯合化療的抗腫瘤機制，與模型組比較，可在不同時期明顯下調CD44的表達水平［24］。

本實驗基于前期復方阿膠漿對lewis 肺癌抑瘤率、外周血象及其他因子的表達的影響研究基礎上發現，復方阿膠漿組、復方阿膠漿大劑量聯合CTX組能明顯下調cyclinD1的表達水平(P＜0.05);復方阿膠漿組、CTX組、復方阿膠漿大、中劑量聯合CTX組能下調CD44的表達，與模型組比較有統計學意義(P＜0.05)。推測復方阿膠漿的抗腫瘤效應可能與干預CyclinD1/CDK4 激活的信號通路、下調CD44的表達從而影響腫瘤細胞的活動能力相關。本研究未發現CyclinD1 與CD44的表達有明顯的統計學相關性，可能二者的作用途徑不存在交叉性。在觀察生存期的實驗中發現復方阿膠漿組的生存時間最長，與模型對照組有明顯的差異。雖然經Kaplan－Meier 法生存分析，未發現在統計學上的差異性，但復方阿膠漿在抗腫瘤、下調上述指標表達的同時，仍有延長生存期的趨勢，今后有待聯合多個指標進一步的研究。

［1］劉君，唐劍敏，王家東.甲狀旁腺腫瘤中細胞周期素D1的表達及其臨床意義［J］.腫瘤，2009，29(1):73－75.

［2］白華，任常山，曲陸榮.P16 蛋白和細胞周期素D1 在子宮內膜癌中的表達及其臨床意義［J］.中國婦幼保健，2009，24(16):2267－2269.

［3］薛明，鐘鳴，王潔，等.成釉細胞瘤中細胞周期素D1及其抑制因子的表達［J］.現代口腔醫學雜志，2008，22(2):164－166.

［4］徐柏平，韓波.非小細胞肺癌細胞周期素D1(CyclinD1)與細胞周期素E(cyclinE)表達特點的研究［J］.齊齊哈爾醫學院學報，2010，31(13):2017－2018.

［5］李素琴，李文才，黃明，等.宮頸腺癌組織中細胞周期素D1 和P27 蛋白的表達［J］.鄭州大學學報:醫學版，2008，43(5):878－880.

［6］鄭翠娥，孔雅，閆瑢，等.肺抑瘤合劑對小鼠Lewis 肺癌p16、p53、cyclinD1 表達影響的實驗研究［J］.中國中醫藥科技，2008，15(2):116.

［7］趙宏賢，陳霞，郭勇，等.粉防己堿對大鼠肝星狀細胞增殖及細胞周期素D1，增殖細胞核抗原表達的調控［J］.時珍國醫國藥，2008，19(1):108－110.

［8］解繼勝，張海燕，都鎮先，等.衣霉素抑制細胞周期蛋白D1 表達而強化TRAIL 誘發凋亡的實驗研究［J］.中國醫科大學學報，2010，39(7):521－524.

［9］江中勇，楊凌，陳清勇.CD44 與肺癌關系的研究進展［J］.國際呼吸雜志，2006，26(2):112－114.

［10］Rodrigo Garzon M，Tirapu Fernondez de la Cuesta I，Arina Iraeta A，et al.Use of gene therapy in a subcutaneous murine model of lung cancer［J］.Arch Bronconeumol，2006，42(10):526－532.

［11］賀駿，阮秋蓉，楊秀萍，等.Pin1 和Cyclin D1 在人類5種常見腫瘤中的表達及其意義［J］.中國組織化學與細胞化學雜志，2006，15(6):608－612.

［12］劉潔，曲波，尹智華，等.女性肺腺癌中細胞周期素D1 表達及意義［J］.中國公共衛生，2008，24(5):521－522.

［13］謝軍，何云.非小細胞肺癌中Cyclin D1 表達及其臨床意義［J］.臨床肺科雜志，2010，15(4):498－499.

［14］曾益華，王岳松，張世杰.PTEN、MAPK、Cyclin D1 在肺癌組織中表達及與其預后的相關性［J］.實用癌癥雜志，2011，26(6):565－569.

［15］呂曉君，辛彥，吳東瑛，等.p16、cyclin D1 在原發性肺癌的表達及其臨床意義［J］.中國醫科大學學報，2005，34(5):466－468.

［16］Ji－ping Zhu，Li－ke Yu，Ping Zhan，et al.The Relationships between Cyclin D1 expression and prognosis of Non－small Cell Lung Cancer［J］.Chin J Lung Cancer，2010，13(8):803－808.

［17］劉宇龍，徐凱，汪波，等.消積飲抑制lewis 肺癌細胞周期及其機制的研究［J］.中醫藥學刊，2002，20(5):608－609.

［18］王立芳，徐振曄，金長娟，等.雙黃升白顆粒對化療所致骨髓抑制Lewis 肺癌荷瘤小鼠細胞周期的雙重調控作用及其機制［J］.中西醫結合學報，2009，7(5):453－457.

［19］王平，朱超男，彭浩，等.MCT1、CD147、CD44 在非小細胞肺癌中表達的相關性及意義［J］.南京醫科大學學報:自然科學版，2012，32(7):976－982.

［20］朱超男，石云，王平，等.MCT1、CD147、CD44 mRNA 在非小細胞肺癌中的表達相關性及意義［J］.第二軍醫大學學報，2012，33(5):528－531.

［21］溫景蕓，林曲，董敏，等.P53、CD44及表皮生長因子受體在非小細胞肺癌中的表達及臨床意義［J］.中國慢性病預防與控制，2011，19(2):192－193.

［22］姚杰，王志剛，童文先，等.腫瘤干細胞標記物CD133 和CD44 在肺癌原發灶及轉移淋巴結中的表達情況［J］.西南國防醫藥，2010，20(12):1300－1303.

［23］蔣士卿，孫宏新，樸炳奎.益肺清化膏對荷瘤小鼠瘤組織CD44、CD44v6、E－cad 等mRNA 表達水平的影響［J］.中醫學報，2010，25(1):17－20.

［24］田甜，張培彤，于明薇，等.蘇木對C57BL/6 小鼠Lewis 肺癌不同時間生長和轉移的影響［J］.中國中西醫結合雜志，2010，30(7):733－737.