5-氟尿嘧啶核苷前藥脂質體對人鼻咽癌HNE-1細胞株增殖抑制與凋亡作用的影響

林 力 鄧 碧*

（重慶市渝北區人民醫院，重慶 401120）

5-氟尿嘧啶核苷前藥脂質體對人鼻咽癌HNE-1細胞株增殖抑制與凋亡作用的影響

林 力 鄧 碧*

（重慶市渝北區人民醫院，重慶 401120）

目的 研究5-氟尿嘧啶核苷前藥脂質體對人鼻咽癌細胞株HNE-1細胞株增殖與凋亡作用的影響。方法 本研究以人鼻咽癌HNE-1細胞株為研究對象，以5-氟尿嘧啶為對照，用四甲基偶氮唑藍（MTT）法測定5-氟尿嘧啶核苷前藥脂質體對HNE-1細胞的增殖抑制率；用流式細胞儀（FCM）測定5-氟尿嘧啶核苷前藥脂質體作用與HNE-1細胞72h后細胞的凋亡率。結果 5-氟尿嘧啶核苷前藥脂質體對HNE-1細胞的IC50是5-氟尿嘧啶的1/3；濃度為0.043μg/mL 5-氟尿嘧啶和5-氟尿嘧啶核苷前藥脂質體作用于HNE-1細胞的凋亡指數分別為（6.31±0.17）%、（19.53±1.79）%。結論 本實驗研究顯示，與5-氟尿嘧啶相比較，5-氟尿嘧啶核苷前藥脂質體對人鼻咽癌HNE-1細胞具有很好的生長增殖抑制作用，并且能夠顯著提高HNE-1細胞的凋亡率。

5-FUR前藥脂質體；HNE-1；細胞凋亡

鼻咽癌（Nasopharyngeal carcinoma，NPC）作為我國南方常見的頭頸部惡性腫瘤之一，目前治療方案早期以放射治療為主，而中晚期則以化療為主[1]。氟尿嘧啶是臨床常用于治療鼻咽癌的化療藥物，但其對正常組織細胞的毒性大，長期使用會嚴重損害機體的各器官組織和免疫系統的功能。為避免或減輕氟尿嘧啶的不良反應，國內外不少學者開展了氟尿嘧啶新劑型的研究工作[2]。5-氟尿嘧啶核苷前藥脂質體（5-fluorouridine prodrug liposome）是氟尿嘧啶類抗腫瘤藥物的新劑型之一，但目前國內外對5-氟尿嘧啶核苷前藥脂質體抗腫瘤作用的研究較少。本實驗擬從細胞增殖抑制及細胞凋亡這兩方面研究5-FUR前藥脂質體對人鼻咽癌HNE-1 細胞株的抗腫瘤作用，為5-FUR前藥脂質體抗腫瘤作用的臨床應用作一初探。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系：人鼻咽癌HNE-1細胞株（購自中科院上海細胞研究所）。

1.1.2 試劑和儀器：RPMI-1640購于Gibco公司，新生牛血清（杭州四季清公司），四甲基偶氮唑鹽（MTT），二甲亞砜（DMSO）均購自重慶醫藥股份公司，5-FU、5-FUR前藥脂質體（重慶醫科大學藥學系王馳副教授惠贈）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養：人鼻咽癌HNE-1細胞在含10%的熱滅活新生牛血清的RPMI1640中種植，37℃，5%CO2飽和濕度、溫度培養箱中生長，0.25%胰酶消化，傳代。使用臺盼藍拒染法計數。

1.2.2 5-FU、5-FUR前藥脂質體對HNE-1細胞的生長抑制試驗：取對數生長期的HNE-1細胞，消化、離心后加入培養液制成懸液，以每孔1×104個細胞接種于96孔細胞培養板中，后分別加入終濃度分別為0.024μg/mL 、0.12μg/mL、0.6μg/mL、3.0μg/mL的5-FU和5-FUR前藥脂質體，每一濃度重復4孔，將細胞培養板放置在37℃，5%CO2條件下培養72h后，每孔加入MTT繼續培養，4h后加入DMSO，檢測每孔吸光度（A）值，計算細胞的生長抑制率，并采用中效濃度公式[3]計算出5-FU和5-FUR前藥脂質體對實驗細胞的IC50。

表1 5-FU與5-FUR前藥脂質體對HNE-1細胞增殖抑制作用的影響

1.2.3 流式細胞儀（FCM）檢測5-FU和5-FUR前藥脂質體作用于實驗細胞的凋亡率：取對數生長期細胞常規消化、離心后加入培養液制成懸液，計數后以每孔5×105個細胞接種于細胞培養板，實驗分別設3組：空白對照組、5-FU、5-氟尿嘧啶核苷前藥脂質體組。其中5-氟尿嘧啶組和5-FUR核苷前藥脂質體組分別以0.045μg/mL的終濃度與實驗細胞共同培養72h后，用不含EDTA的胰酶消化收集處理過的細胞5 ×105個，加入PI染液充分混勻避光反應，4℃放置30min后用FCM檢測細胞的凋亡率。

1.2.4 統計學方法：使用SPSS10.0統計學軟件進行分析。全部計量資料采用表示，2組資料比較采用t檢驗。

2 結 果

2.1 5-FUR和5-FUR前藥脂質體對HNE-1細胞的體外抑制試驗

通過細胞預實驗我們得出空白脂質體對實驗細胞株的抑制率均＜10%，因此可忽略其對實驗細胞的毒性作用。

在濃度為0.024μg/mL、0.12μg/mL、0.6μg/mL、3.0μg/mL的5-FU與5-FUR前藥脂質體分別作用下，HNE-1細胞的增殖抑制率分別為：（22.01±1.17）%、（31.51±1.21）%、（60.87±3.11）%、（87.31± 2.19）%；（24.63±1.33）%、（63.15±1.73）%、（80.49±3.17）%、（91.16±4.28）%。在各濃度點，5-FUR前藥脂質體作用于HNE-1細胞的生長抑制率在各濃度點均高于5-FU，差異有統計學意義（P＜0.05）。使用IC50公式計算出：5-FUR前藥脂質體的IC50為0.087μg/mL；5-FU對HNE-1的IC50為0.261μg/mL；5-氟尿嘧啶核苷前藥脂質體的IC50是5-氟尿嘧啶的1/3，見表1。

2.2 流式細胞儀（FCM）檢測細胞的凋亡率

對照組的凋亡率為：（1.37±0.91）%。采用終濃度為0.045μg/ mL的5-FU和5-FUR前藥脂質體作用于HNE-1細胞的凋亡率分別為（6.31±0.17）%、（19.53±1.79）%，二者相比較，差異有顯著性（P＜0.05）。5-氟尿嘧啶核苷前藥脂質體組的凋亡率比5-氟尿嘧啶增加了13.22%，是5-FU的3倍。見圖1。

圖1 FCM檢測HNE-1細胞的凋亡率

3 討 論

脂質體[4]作為一種具有良好靶向性，高選擇性和通透性的微囊泡是目前較為理想的抗腫瘤藥物載體。因其具有磷脂雙分子層液晶膜的結構，可以包埋轉運脂溶性和水溶性藥物，并使藥物從脂質體中緩慢釋放，從而使藥物作用時間增加；還可通過細胞的融合和內吞作用直接將藥物送入腫瘤細胞內，減少腫瘤藥物的使用濃度，降低對游離藥物對組織細胞的毒副作用，提高抗腫瘤藥物的療效，同時脂質體進入體內能被降解，免疫原性小[5]。

5-氟尿嘧啶核苷是氟尿嘧啶類抗腫瘤藥物發揮作用的活性形式，也是制備多種抗腫瘤藥物的前體，其抗腫瘤活性遠高于臨床上應用的氟尿嘧啶類藥物，但引起毒副作用大，故未能應用于臨床[6]。研究顯示將具有較強抗腫瘤活性的5-FUR結構進行修飾，使其由水溶性轉變為脂溶性，再用脂質體將其進行包裹，制備成5-FUR前藥脂質體，從而達到既能使其抗腫瘤活性得以發揮，又能降低其毒性的目的[7]。目前國內外對5-FUR前藥脂質體在體內外抗腫瘤作用的研究較少。本實驗以5-氟尿嘧啶為對照，本實驗擬從細胞增殖抑制及細胞凋亡這兩方面研究5-FUR前藥脂質體對人鼻咽癌HNE-1 細胞株腫瘤作用，對5-FUR前藥脂質體抗腫瘤作用臨床應用作一初探。

本實驗以頭頸腫瘤中常見的鼻咽癌HNE-1細胞株為研究對象，以5-FU為對照，通過MTT法、FCM法檢測5-FUR前藥脂質體對HNE-1細胞生長增殖抑制和凋亡的影響。結果顯示：①5-氟尿嘧啶核苷前藥脂質體對實驗細胞的IC50是5-FU的1/3倍，說明5-氟尿嘧啶核苷前藥脂質體可明顯減少鼻咽癌HNE-1細胞內抗腫瘤藥物的用量，降低藥物的毒性。這與Paola C[8]等研究發現5-FUR前藥脂質體對HT-29細胞株具有較強的增殖抑制作用相符。②5-FUR前藥脂質體和5-FUR作用于HNE-1細胞的凋亡率分別為（6.31±0.17）%、（19.53±1.79）%。5-氟尿嘧啶核苷前藥脂質體組比5-氟尿嘧啶的凋亡率減少了13.22%。

綜上所述，本實驗研究顯示，與5-氟尿嘧啶相比較，5-氟尿嘧啶核苷前藥脂質體對人鼻咽癌HNE-1細胞具有較強的生長抑制作用，能夠顯著誘導HNE-1細胞株凋亡。本實驗為5-FUR前藥脂質體作為氟尿嘧啶類藥物的新劑型在頭頸腫瘤方面的應用作一初探。

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[7] 朱莉,潘黎軍.5-氟尿嘧啶核苷前藥脂質體中磷脂含量的測定[J].中國藥房,2008,19(7):547-548.

[8] Crosasso P.Antitumoral activity of liposomes and immunoliposomes containing 5-fluorouridine prodrugs.Journal of Phamaceutica[J]. Sciences,1997,86(7):832-839.

The Effect of 5-FUR Prodrug Liposome on Laryngeal Cancer HNE-1 Cell Line

LIN Li, DENG Bi*
（The People’s Hospital of Yubei District, Chongqing 401120,China ）

Objective To compare the Effect of the proliferation inhibition and apoptosis of HNE-1 cell line by 5-FU and 5-FUR prodrug liposome. Method MTT reduction assay was used to investigate the proliferation inhibition of 5-FU and 5-FUR prodrug liposome on HNE-1 cell line..FCM was used to detecet the apoptosis rate of cell after using the drugs. Result The IC50 of 5-FU on HNE-1 cell line was 300% to 5-FUR prodrug liposome. Treated with 5-FU and 5-FUR prodrug liposome respectively, the apoptosis rate of HNE-1 were:（6.31±0.17）%、（19.53±1.79）%. Conclusion 5-FUR prodrug liposome was better than 5-FU in inhibiting the proliferation and raising the apoptosis rate of HNE-1 cell line.

5-FUR prodrug liposome; HNE-1; Apoptosis

739.6

B

1671-8194（2013）33-0021-02

*通訊作者：E-mail：523141304@qq.com.