熒光光譜法研究昂丹司瓊與人血清白蛋白的相互作用

王 琛

（1 山西醫(yī)科大學，山西 太原 030001；2 山西省眼科醫(yī)院，山西 太原 030002）

熒光光譜法研究昂丹司瓊與人血清白蛋白的相互作用

王 琛1,2

（1 山西醫(yī)科大學，山西 太原 030001；2 山西省眼科醫(yī)院，山西 太原 030002）

目的利用熒光光譜法研究昂丹司瓊(OND)與人血清白蛋白(HSA)的相互作用。方法采用熒光光譜法。結果在296K和310K時OND與HSA的結合常數(shù)分別為3.24×104L/mol，4.68×104L/mol，熱力學參數(shù)ΔH為20.08kJ/mol。結論OND對HSA的熒光猝滅機制主要為靜態(tài)猝滅，二者有一個結合位點，其作用力類型以疏水作用力為主。

昂丹司瓊；人血清白蛋白；熒光光譜

昂丹司瓊（Ondansetron，OND）為一種新型強效、高度選擇性的5-HT3受體拮抗劑，已廣泛地應用于治療各種原因所致的惡心、嘔吐[1-2]。人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）是人體血漿中含量最為豐富的載體蛋白，含量約為0.6mmol/L，約占人體內血漿總蛋白含量的60%[3-5]。探討藥物小分子與蛋白的相互作用，對于研究藥物的作用機制具有重要的指導意義。近些年已有不少關于藥物小分子與HSA相互作用的報道，但尚未見采用熒光光譜研究OND與HSA相互作用的報道。本實驗采用熒光光譜法研究了OND與HSA的相互作用，并討論了OND對HSA的猝滅機制、結合常數(shù)以及結合力類型等，對于闡明昂丹司瓊的體內過程具有一定意義。

1 儀器與試劑

F2500熒光光度計（日本日立公司）；AY-120M電子分析天平（日本島津公司）；SYC-15超級恒溫水浴（南京桑力電子設備廠）；Biohit加樣器（芬蘭，biohit公司），PHS-3C數(shù)字酸度計（上海雷磁分析儀器廠）。

昂丹司瓊（濟南德誠和牧醫(yī)藥科技有限公司，純度99%），人血清白蛋白（HSA，上海生物制品研究所，純度95%，分子量66500），三羥甲基氨基甲烷（Tris），所用試劑均為分析純，實驗用水為二次蒸餾水，經(jīng)檢測均無熒光雜質。

2 實驗方法

按照文獻方法[6-9]依次配置Tris-HCl緩沖溶液，1.0×10-5mol/L的HSA溶液，5.5×10-3mol/L的OND溶液。用加樣器移取2mLTris-HCl緩沖溶液和100μLHSA母液置于1cm的石英池中，然后逐次加入2μL的OND母液，在F2500熒光光度計上設置280nm為激發(fā)波長，激發(fā)狹縫寬度和發(fā)射狹縫寬度均為5nm，在波長300～455nm范圍內以1200nm/ min的速度掃描熒光光譜并測定熒光強度。

3 結果與討論

3.1 昂丹司瓊與HSA結合的熒光光譜

根據(jù)實驗方法掃描熒光發(fā)射光譜，見圖1。 由圖1可知，昂丹司瓊可猝滅HSA的內源性熒光。其作用過程遵循Stern-Volmer方程[10]：

式中，F(xiàn)0為猝滅劑不在時的熒光強度；F為加入猝滅劑后的熒光強度；[Q]為猝滅劑Q的濃度；Kq為雙分子猝滅速率常數(shù)；τ0為熒光體的熒光壽命；KD為Stern-Volmer方程的猝滅常數(shù)。

圖1 昂丹司瓊與HSA作用的熒光猝滅光譜[HSA]= 0.5×10-6mol/L，[OND]=(0，0.55，1.10，1.65，2.20，2.75，3.30，3.85，4.40，4.95，5.50)×10-5mol/L

3.2 熒光猝滅及碎滅機理

本實驗分別測定了293K、310K溫度下，昂丹司瓊對HSA的內源性熒光產(chǎn)生猝滅的情況。以F0/F對藥物濃度[Q]作圖，結果見圖2，由Stern-Volmer曲線的斜率即可求得猝滅常數(shù)KD，根據(jù)Kq=KD/τ0，τ0≈10-8s可進一步求得Kq，所求得的Kq和KD見表1。

由圖2可以看出，昂丹司瓊對HSA分子熒光猝滅的Stern-Volmer曲線斜率隨著溫度升高而降低，結果表明昂丹司瓊對HSA分子熒光猝滅效率隨溫度升高而降低，符合靜態(tài)猝滅的特征[10]，據(jù)此可以判斷，昂丹司瓊對HSA分子的熒光猝滅屬于靜態(tài)猝滅。此外，表1中不同溫度下Kq值均遠大于2.0×1010L/（mol·s），進一步證實昂丹司瓊對HSA分子的熒光猝滅屬于靜態(tài)猝滅。

圖2 昂丹司瓊與HSA作用不同溫度下的Stern-Volmer曲線

3.3 結合位點數(shù)n和結合常數(shù)K的確定

以Lg（F0/F-1）對Lg[Q]作圖3，由圖3中直線的斜率和截距可求出昂丹司瓊與HSA分子的結合位點數(shù) 和結合常數(shù) ，結果見表1。由表1可知，昂丹司瓊與HSA有一個結合位點，此外隨著溫度的升高結合常數(shù)K由3.24×104L/mol增大至4.68×104L/mol，說明溫度的升高使昂丹司瓊與HSA形成的復合物的穩(wěn)定性增強。

圖3 不同溫度下昂丹司瓊與HSA作用的雙對數(shù)曲線

3.4 昂丹司瓊與HSA之間相互作用力類型的確定

結合本實驗中昂丹司瓊與HSA在不同溫度下的結合常數(shù)，可以求得昂丹司瓊與HSA結合作用過程中的焓變ΔH，熵變ΔS，吉布斯自由能的變化ΔG等熱力學參數(shù)，結果見表1。

從表1數(shù)據(jù)中可以看出OND-HSA體系中ΔH＞0，ΔS＞0，說明昂丹司瓊與HSA之間作用力是以疏水作用力為主[11，12]。ΔH＞0，說明分應為吸熱反應，進一步證實溫度的升高，有利于昂丹司瓊與HSA結合反應的進行。

4 結 論

本實驗利用熒光光譜法研究了昂丹司瓊與HSA的相互作用，結果表明，昂丹司瓊對HSA的內源性熒光有明顯的猝滅機制主要為靜態(tài)猝滅，結合位點數(shù)約為1，昂丹司瓊對HSA作用力類型主要為疏水作用力。

[1] Panda NB,Bharadwaj N,Kapoor P,et al.Prevention of nausea and vomiting after middle ear surgery:combination of ondansetron and dexamethasone is the right choice[J].J Otolaryngol,2004,33(2):88-92.

[2] 李步龍,吳凱,紅詹鴻.樞丹預防婦科術后惡心嘔吐的臨床觀察[J].臨床麻醉學雜志,1999,15(5):304-305..

[3] Sudlow G,Birkett DJ,Wade DN.Further characterization of specific drug binding sites on human serum albumin [J].Mol Pharmacol,1976,12(6):1052.

[4] Kragh-Hansen U.Molecular aspects of ligand binding to serum albumin[J].Pharmacol Rev March,1981,33(1):17-53.

表1 昂丹司瓊與HSA的猝滅常數(shù)與熱力學參數(shù)

[5] Peters TJ.All about Albumin:Biochemistry,Genetics,and Medical Applications[M].San Diego: Academic Press,1996:452.

[6] Carter D,Chang B,Ho JX,et al.Preliminary crystallographic studies of four crystal forms of serum albuim[J].Eur J Biochem,1 994,226(3):1049.

[7] Carter D,Ho JX.Structure of serum albumin[J].Adv Protein Chem,1994,45:153.

[8] Brown JR,Shockley P.Lipid-Protein Interactions,Vol. 1[M]. Wiley:New York,1982.

[9] 慕麗曉.抗生素類藥物和人血清白蛋白相互作用的研究[D].太原:山西大學,2012.

[10] Lakowicz JR.Principles of Fluorescence Spectroscopy(Third Edition)[M].Singapore: Springer-Verlag,2006:278-280

[11] Ross PD,Subramanian S.Thermodynamics of Protein Association Reactions:Forces Contributing[J].Biochemistry,198 1,20(21):3096-3012.

[12] Mohammed HR,Toru M,Tomoko O,et al.Study of interaction of carprofen and its enantiomers with human serum albumin-I mechansim of binding studied by dialysis and spectroscopic methods[J].Biochem Pham,1993,46(10):1721-1731.

Study on the Interaetion for Human Serum Albumin with Ondansetron by Fluorescence Spectrometry

WANG Chen1,2

(1 Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China; 2 Shanxi Eye Hospital, Taiyuan 030002, China)

ObjectiveStudy on the interaetion for human serum albumin with ondansetron by Fluorescence Spectrometry.MethodsFluorescence spectrometry was used.ResultsThe binding constants were 3.24×104L/mol, 4.68×104L/mol. The thermodynamic parameters ΔH was 20.08kJ/mol.ConclusionThe fluorescence quenching of HSA by OND indicated that the quenching mechanism was a static quenching, and the thermodynamic parameters showed that the interaction of OND and HSA was mainly driven by hydrophobic force.

Ondansetron; Human serum albumin; Fluorescence spectrometry

R914

B

1671-8194（2013）15-0010-03