鎂合金涂覆不同濃度硅-羥基磷酸鈣后的體外生物相容性評價

張柱武 潘 鋒

（本溪市衛生學校，遼寧 本溪 117022）

鎂合金涂覆不同濃度硅-羥基磷酸鈣后的體外生物相容性評價

張柱武 潘 鋒

（本溪市衛生學校，遼寧 本溪 117022）

目的利用大鼠成骨細胞在體外評價使用硅-羥基磷酸鈣涂覆的鎂合金的毒性反應。方法利用大鼠顱骨培養第三代成骨細胞，之后與二種覆有不同硅-羥基磷酸鈣涂層的鎂合金進行共培養，之后通過細胞活力檢測、堿性磷酸酶檢測、掃描電鏡觀察評估細胞生長情況。結果細胞活力檢測和堿性磷酸酶檢測表明，第一種硅（12%）-羥基磷酸鈣涂覆的鎂合金利于成骨細胞的生長；掃描電鏡下可見成骨細胞在第一種硅（12%）-羥基磷酸鈣涂層表面的鎂合金生長均勻，增殖明顯。結論硅含量在12%的硅-羥基磷酸鈣涂層利于成骨細胞的體外黏附和生長。

成骨細胞；鎂合金；硅-羥基磷酸鈣

臨床上發現鈦合金、不銹鋼制作的骨釘和骨板存在著“應力屏”現象，且需要二次手術取出固定物[1]。鎂合金制作的骨科固定物具有降解性，表現越來越多的優點[2]。因此，鎂合金具有很大的潛力取代鈦合金和不銹鋼 。目前鎂合金在動物體內的實驗僅發現皮下可產生局部微小氣泡。如能對其改性使其更加完美。本研究在鎂合金表面涂覆兩種不同硅含量（12%和20%）的羥基磷酸鈣，檢測其在體外與成骨細胞的相容性問題。

1 材料與方法

1.1 合金制備

在99%CO2和1%SF6（六氟化硫）氣體保護下，將電阻爐上里面的熔煉溫度控制在800±50℃以內。按質量百分比，合金采用99.99%純鎂、99.99%純鋅、化學純MnCl2和金屬鈣熔配，將熔煉后的合金在金屬模中鑄造成型。上述方法所制備出來的Mg-Mn-Zn的重量百分比分別為：Mn為1.2%，Zn為1.0%，余者為Mg[3]。

1.2 涂層制備

對加工好的圓盤形鎂合金使用Ca（OH）2和NaOH進行處理，再做熱處理，用預配好硅-羥基磷灰石仿生溶液（在仿生溶液中加入不同比例的SiO32-溶液調節硅濃度）浸泡，之后使用熱處理制備出12%和20%硅濃度的不同的硅-羥基磷酸鈣涂覆層[4]。將上述兩組涂覆層用紫外線照射消毒。

1.3 細胞培養及其鑒定

取SD乳鼠（SPF級，中國醫科大學實驗動物部）置入75%酒精消毒后剪開乳鼠頭部皮膚暴露顱骨并剔除其上附著的軟組織及骨膜，剪下顱骨后用PBS清洗數次放入培養皿中剪碎，再置入37℃，5%CO2培養箱中用0.25%胰蛋白酶消化5min。之后再加入0.1% I型膠原酶繼續消化，每隔15min收集一次消化液，最后將收集到的所有消化液放入離心管中1000rpm離心5min，棄上清，用培養液將沉淀吹打后加入含10%胎牛血清的高糖DMEM培養液，接種在50mL培養瓶中。取培養第3代細胞并按照1×105/mL接種于6孔培養板中（每孔均加入蓋玻片），待細胞爬片后，取出蓋玻片并用PBS沖洗，之后10%福爾馬林固定，茜素紅S染液染色5min，丙酮二甲苯混合液沖洗，顯微鏡下觀察。取出已爬有細胞的蓋玻片，加兔抗大鼠I型膠原抗體 （武漢博士德），37℃孵育1h，再加Cy3標記的羊抗兔IgG（武漢博士德），37℃孵育1h，PBS沖洗3次，加入4'，6-二脒基-2-苯基吲哚復染細胞核，熒光顯微鏡下觀察。

1.4 掃描電鏡觀察

取第3代成骨細胞按2×105/mL接種于各組合金表面，放入37℃，5%CO2的細胞培養箱內分別培養6、12、24h后取出，PBS清洗后戊二醛固定24h，梯度酒精脫水、CO2臨界點干燥并噴金后，SSX-550掃描電子顯微鏡觀察。

1.5 細胞活力檢測

將各合金組按3cm2/mL（表面積/浸提介質）制備高糖DMEM浸提液，之后使用浸提液培養接種于96孔培養板中的成骨細胞，接種濃度為1×104/mL，對照組為DMEM培養液，分別培養12、24、48h后棄掉液體加入5mg/mL的3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽20μl，4h后PBS清洗，加入120μl二甲基亞砜，震蕩溶解1min，酶標儀測定吸光值。

1.6 堿性磷酸酶檢測

使用1.5步驟制備的浸提液培養接種于6孔培養板中的成骨細胞，接種濃度為1×105/mL，對照組為DMEM培養液，分別培養12、24、48h后吹打消化，超聲粉碎，用堿性磷酸酶活度試劑盒（昊柏生物科技有限公司）檢測細胞的ALP活性。

1.7 統計學分析

所有數據全用均數±標準差表示。組間比較采用多因素方差分析。數據處理過程用SPSS16.0軟件完成。

2 結 果

2.1 成骨細胞的形態學觀察和鑒定

倒置顯微鏡觀察見原代培養24h出現貼壁細胞，48h出現集落樣生長的細胞，傳代后細胞多呈梭形或多角形，多突起，核橢圓, 核仁多而明顯。熒光顯微鏡觀察見紅色熒光分布于細胞胞漿，藍色熒光分布于細胞核，正置顯微鏡觀察則見有被茜素紅染為紅色的礦化結節存在。

2.2 掃描電鏡觀察

掃描電鏡觀察可見：在培養6、12、24h，含硅12%涂覆層表面有明顯細胞生長，細胞分布均一，細胞形態多鋪展為梭形或多角形陰影；含硅20%涂覆層表面細胞生長不甚明顯，培養12及24h后，細胞突起明顯減少，特別是在培養24h后，細胞突起明顯回縮，不能很好黏附。

2.3 細胞活力

含硅12%涂覆層OD值隨培養時間的延長呈上升趨勢，至48h以后，呈平緩趨勢；含硅20%涂覆層OD值隨培養時間延長而呈明顯下降趨勢，兩組之間差異明顯（P＜0.05）（圖1）。

2.4 ALP活性

浸提液培養12h，兩組之間均沒有差異（P＞0.05）；在培養24h后，含硅12%涂覆層的ALP活性明顯高于含硅20%涂覆層，存在顯著性差異（P＜0.01）（圖2）。

3 討 論

圖1

圖2

鎂合金在人體內釋放出的鎂離子有益于人體的各種需要[10]。但沒有涂層的鎂合金在體內的過快降解不利于對骨的固定。因此，在鎂合金表面涂覆一定的防止過快收到體液侵蝕的物質顯得非常必要。硅-羥基磷酸鈣復合物和含硅-磷酸鈣復合物均是較好的防侵蝕材料[11]，有研?究表明，硅能夠影響成骨細胞的黏附和生長，這樣硅也就間接地影響了骨的生長和發育。人體骨中正常的硅含量為100ppm。這說明硅在骨的正常形成過程中有非常重要作用。因此，采實驗采用了用硅-羥基磷酸鈣涂覆鎂合金來獲得最佳的可植入體內的涂層。實驗中掃描電鏡觀察和細胞活力測試都表明涂覆12%硅-羥基磷酸鈣的鎂合金能夠很好地促進細胞生長。所用Mg-Mn-Zn合金并不含有有毒的金屬鋁成分。已經過實驗證明：Mn參與體內多種酶的活動，是酶的激活劑，并能促進新陳代謝，合金中的Mn含量為1.2%，其降解過程不會危及細胞的生存；Zn則可增強人體免疫功能，更是維持生命正常活動的關鍵因素，合金中的Zn含量為1.0%，對人體也不會造成損害；Mg在合金中占有的比重比較大，經研究發現鎂在維持心臟、神經、肌肉的正常功能有重要作用。本實驗發現了含12%硅-羥基磷酸鈣的良好生物相容性，但還需要進一步地研究涂覆層的最佳厚度問題，這需要在制作工藝過程中，把握好仿生液與鎂合金的反應時間問題。如果在相容性和防侵蝕涂層厚度上，都能很好地找出相關實驗數據，將可很好地解決裸鎂合金在體內的過快降解問題，制作出一種既能降解又能免除二次手術的骨科固定材料。

[1] 劉振東,范清宇.應力遮擋效應-尋找丟失的鑰匙[J].中華創傷骨科雜志,2002,4(1):62.

[2] Kim SR,Lee JH,Kim YT,et al.Synthesisi of Si,Mg substituted hydroxypatatites and their sintering behaviors[J].Biomaterials,20 03,24(5):1389-1398.

[3] 張二林,楊磊,杜輝,等.醫用可吸收Mg-Mn-Zn-Ca鎂合金[P].中國:200810012384.3.2010-01-20.

[4] 張二林,周鶉鳴,楊柯.一種制備含硅羥基磷酸鈣涂層的仿生溶液及仿生方法[P].中國:200810012661.0.2010-02-10.

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B

1671-8194（2013）15-0104-02