常壓柱色譜與快速制備色譜分離純化洋鐵酸模中蒽醌成分

孫全樂 蔡廣知 殷 丹 貢濟宇

（長春醫學高等專科學校，吉林 長春 130031）

常壓柱色譜與快速制備色譜分離純化洋鐵酸模中蒽醌成分

孫全樂 蔡廣知 殷 丹 貢濟宇

（長春醫學高等專科學校，吉林 長春 130031）

目的 比較常壓柱色譜與快速制備色譜分離洋鐵酸模蒽醌成分純化程度。方法 常壓柱色譜柱采用硅膠（200～300目），流速15mL/min；快速制備色譜法柱采用FlashCS硅膠柱（柱規格40g），流速40mL/min。兩方法均以石油醚-乙酸乙酯為洗脫劑，檢測波長254nm。結果 洋鐵酸模乙酸乙酯萃取物經兩種色譜法分離后得到蒽醌類成分之大黃素，經超高效液相分析，純度差異不大。常壓柱色譜中，分離過程溶劑經洗脫再回收利用后消耗量大，耗時較長。與快速制備色譜相比，該法快速、準確、靈敏度高。結論 快速制備色譜法可準確、快速、高效分離洋鐵酸模蒽醌成分，適合在工作量較大的分離純化項目中應用；但快速制備分離色譜通常難以勝任對藥物復雜體系如較多類物質的分離。

洋鐵酸模；快速液相色譜法；大黃素

洋鐵酸模作為一種古老的中草藥，在民間應用已有上千年的歷史，多采該藥治療皮膚疾患和止血[1-3]，臨床應用比較廣泛[4]，有著確切療效。洋鐵酸模在我省廣泛分布，資源豐富。開發潛力巨大，應用前景廣闊。洋鐵酸模乙酸乙酯萃取物經常壓柱色譜與快速制備色譜兩種色譜法分離后得到蒽醌類成分之大黃酚，經超高效液相分析，純度差異不大。常壓柱色譜中，分離過程溶劑經洗脫再回收利用后消耗量大，耗時較長。與快速制備色譜相比，該法快速、準確、靈敏度高。結論：快速制備色譜法可準確、快速、高效分離洋鐵酸模蒽醌成分，適合在工作量較大的分離純化項目中應用。

1 儀器與試藥

Combiflash自動快速制備色譜（Sq-16x），常壓柱（手動裝柱硅膠柱），超高效液相色譜儀（waters UPLC）。

大黃素對照品（批號110756-200110，含量98.0%），洋鐵酸模根部粉末（采集于吉林），石油醚，乙酸乙酯，乙醇均為分析純。

2 方法與結果

2.1 供試品與對照品溶液的制備

2.1.1 供試品溶液

洋鐵酸模藥材粗粉100g，乙酸乙酯回流提取兩次，每次2h，合并提取液，過濾，減壓回收乙酸乙酯；提取物選用D101型大孔樹脂柱層析達到初分離的目的，洗脫劑以30%乙醇、60%乙醇、90%乙醇進行梯度洗脫。所得90%乙醇洗脫液，作為兩種柱色譜待分離的供試品液。

2.1.2 對照品溶液

精密稱取大黃素標準品適量，加甲醇溶解，制成1.00mg/mL的大黃素標準品儲備液，備用。

2.2 實驗方法

將90%乙醇洗脫液供試品液以干法上樣，以石油醚-乙酸乙酯不同比例進行梯度洗脫。常壓柱色譜柱與快速制備色譜法柱各參數比較，見表1。

表1 常壓色譜法與快速制備色譜法比較

2.3 結果

2.3.1 色譜行為

常壓柱色譜洗下的洗脫液結合薄層色譜進行檢識，將同-Rf值的斑點合并；快速制備色譜法采用軟件分析，直接將在254nm下有吸收的洗脫液按峰值合并。自動快速色譜分離制備色譜中洗脫液按11～21號試管合并，結果見圖1。

圖1 自動快速色譜分離制備色譜

2.3.2 方法學驗證

經兩種色譜方法處理所得洗脫液的合并液中，均得到與大黃素標準品Rf值一致的斑點，將此部分洗脫液回收溶劑后，利用超高效液相色譜儀分析分析其純度。色譜柱：ACQUITY UPLCTM BEH C18（1.7μm，2.1mm×50mm），流動相：乙腈-0.1%磷酸（60∶40）；流速：0.25mL/min；柱溫：30℃；檢測波長：254nm。

線性范圍和最低檢測限 分別吸取對照品溶液3、4、5、6、7、8、9μL注入超高效液相色譜儀，按上述色譜條件測定，記錄峰面積積分值和保留時間，計算得大黃素回歸方程：y=6×106x-301050，r=0.9999，表明大黃素在0.09～0.27μg范圍內與峰面積積分值具有良好的線性關系。

精密度：取對照品溶液2μL注入超高效相色譜儀，重復進樣5次，RSD為0.41%。

重復性和溶液穩定性 取常壓柱色譜所得大黃素供試品注入高效相色譜儀，重復進樣5次，平均含量為104.5%，RSD為1.7%。另取常壓和快速制備液相色譜分別在室溫放置24h后測定。24h后主峰峰面積減失百分率＜2%，結果表明供試品溶液在24h內較穩定。

2.4 樣品測定

分別取常壓柱色譜和快速制備色譜所得大黃素供試品，用超高效液相法測定，外標法計算含量。結果進行配對t檢驗，兩種色譜所得大黃素的含量結果相近。

3 討 論

在常壓柱色譜應用中，樣品通常與硅膠的固體載體一起置于柱頂端。然后在柱頂端灌置溶劑（混合溶劑），依靠重力進行溶劑洗脫。但此方法本身固有的缺點不可忽視：低柱效；收集組分耗時；對復雜樣品效果不好或需反復操作；柱間重現性不好；只限于等度或分階式洗脫；沒有在線監測，只能手動結合TLC薄層檢識。

而在快速色譜中，柱子是用更細的填料如硅膠填充，通常柱系統在中壓下運行的分離效率更高。計量泵用于傳輸溶劑，取代正壓空氣驅動；系統裝置在線檢測器及專用的組分收集器。我們只需借助功能鍵，純化就可開始，組分將會得到只能化切分，分離過程十分省時。

本實驗采用ISCO開發出Combiflash?自動快速色譜分離制備系列產品Sq-16x，其具有克自動識別所裝色譜柱尺寸并自動選擇最佳柱效的運行程序；雙泵全梯度能力，梯度控制更加精確靈活，泵可與任何實驗室用溶劑容器相連；實時的方法控制設定參數-包括形成曲線梯度用高通量。峰切割軟件得到純化化合物，當化合物被檢測到未完時自動運行所有峰的擴展收集等特點[5]。

傳統的柱色譜基本上是使用長柱和常壓驅動的色譜過程。分離效果對洗脫速度敏感，相對快的洗脫速度對于分離效果是有利的。隨著藥物研發和有機化學研究的發展，對通量的要求加大，而手動操作的柱色譜不能滿足日益增加的純化要求，自動快速色譜系統便成為解決純化瓶頸問題的流行技術。但快速制備分離色譜通常難以勝任對藥物復雜體系如較多類物質的分離。

[1] 國家中醫藥管理局《中華本草》編委會.中華本草[M].上海:上海科學技術出版社,1999: 708-721.

[2] 常新全,丁麗霞.中藥活性成分分析手冊[M].北京:學苑出版社,2001: 145-146.

[3] 祁紅.大黃素的抗炎作用[J].中草藥,1999,30(7):522.

[4] 周雄,宣利江,張書偉.中藥羊蹄的化學成分研究[J].中藥材,2005,28(2):104-105.

[5] Danielsen K,Eksenes DW,Francis GW.NMR study of some anthraquinones from Rhubarb[J].Magn Reson Chem,1992,30(3):395.

R914

B

1671-8194（2013）33-0052-02