甲硝唑栓微生物限度檢查方法學(xué)驗(yàn)證

費(fèi)夷敏 洪 巖 魏宇梅 林夢感 楊國紅 王曙光*

（上?，F(xiàn)代制藥股份有限公司，上海 201802）

甲硝唑栓微生物限度檢查方法學(xué)驗(yàn)證

費(fèi)夷敏 洪 巖 魏宇梅 林夢感 楊國紅 王曙光*

（上海現(xiàn)代制藥股份有限公司，上海 201802）

目的 建立甲硝唑栓的微生物限度檢查方法。方法 按照《中華人民共和國藥典》2010版二部修訂版的新要求進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，采用了薄膜過濾法對細(xì)菌、真菌及酵母菌計數(shù)和控制菌的檢查。結(jié)果 細(xì)菌、真菌及酵母菌的回收率均70.0%以上，控制菌檢查中，各陽性試驗(yàn)菌均檢出，陰性對照無菌生長。結(jié)論 薄膜過濾法可消除甲硝唑栓的抑菌作用，適用于該制劑的微生物限度檢查。

甲硝唑栓；微生物限度檢查；薄膜過濾法；驗(yàn)證

甲硝唑栓具有抗原生動物和專性厭氧細(xì)菌的作用，適用于治療滴蟲性陰道炎及敏感厭氧菌所引起的細(xì)菌性陰道病，是婦科的常用藥物[1]。為了能夠有效的控制甲硝唑栓的質(zhì)量，及保證甲硝唑栓微生物限度檢查方法的科學(xué)性和檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，筆者依據(jù)《中華人民共和國藥典》2010版二部修訂版對微生物限度檢查的最新要求，進(jìn)行了微生物限度檢查方法學(xué)的驗(yàn)證。

1 材 料

1.1 培養(yǎng)基與試劑

胰酪大豆胨瓊脂、沙氏葡萄糖瓊脂、胰酪大豆胨肉湯、甘露醇氯化鈉培養(yǎng)基、溴化十六烷基三甲銨、沙氏葡萄糖肉湯、沙氏葡萄糖瓊脂、十四烷酸異丙酯。

1.2 菌種

金黃色葡萄球菌CMCC（B）26003、銅綠假單胞菌CMCC（B）10104、枯草芽孢桿菌CMCC（B）63501、白色念珠菌CMCC（F）98001。本次微生物驗(yàn)證所使用的菌種均來源于上海市藥品檢驗(yàn)所，且菌株傳代均不超過5代，并采用適宜的菌種保藏技術(shù)，以保證試驗(yàn)菌株的生物學(xué)特性。

1.3 樣品

甲硝唑栓(上?，F(xiàn)代制藥股份有限公司,批號:130301規(guī)格:0.5g)。

1.4 儀器

電動吸引器、細(xì)菌培養(yǎng)箱、 霉菌培養(yǎng)箱、隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱、蒸汽滅菌器、濾器、凈化工作臺、藥物天平、錐形瓶、試管、培養(yǎng)皿（9cm）、微量移液器。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌液的制備

取經(jīng)過培養(yǎng)箱30～35℃培養(yǎng)24h的金黃色葡萄球菌（26003）、銅綠假單胞菌（10104）、枯草芽孢桿菌（63501）肉湯培養(yǎng)物，以10倍稀釋至含50～100cfu/mL，做活菌計數(shù)用。取經(jīng)20～25℃培養(yǎng)24h的白色念珠菌（98001）霉菌液體培養(yǎng)物，以10倍稀釋至含50～100cfu/mL，做活菌計數(shù)用。

2.2 供試液的制備

無菌稱取甲硝唑栓供試品10g至含有無菌十四烷酸異丙酯的pH 7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液20mL中（內(nèi)含玻璃珠），振搖20～30min，使供試品完全溶解，然后加入45℃pH 7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液至100mL混勻，用分液漏斗萃取，靜置，待水明顯分層時，取其水層，作為1∶10的供試液。

2.3 細(xì)菌、真菌及酵母菌計數(shù)方法驗(yàn)證

2.3.1 試驗(yàn)組

取供試液1mL放入到pH 7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液500mL中，混勻后注人無菌濾杯中，進(jìn)行薄膜過濾。再用pH 7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液沖洗濾膜每次100mL，總沖洗量為500mL消除抑菌作用，并在最后一次的沖洗中加入了1mL的試驗(yàn)菌（銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌），平行制備2份，取濾膜貼反面于胰酪大豆胨瓊脂平皿上，至規(guī)定溫度培養(yǎng)觀察結(jié)果[2]。取供試液10mL放入到pH 7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液500mL中，混勻后注人無菌濾杯中，進(jìn)行薄膜過濾。再用pH 7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液500mL沖洗濾膜（每次100mL）消除抑菌作用，在最后一次的沖洗中加入試驗(yàn)菌（白色念珠菌）菌液1mL，平行制備2份，取濾膜貼反面于沙氏4%葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平皿上，至規(guī)定溫度培養(yǎng)觀察結(jié)果。按中國藥典2010版二部--增補(bǔ)本XIIIH進(jìn)行微生物檢查[3]。（n=3）。

表1 銅綠假單胞菌

表2 金黃色葡萄球菌

表3 枯草芽孢桿菌

表4 白色念珠菌

2.3.2 菌液組

測定所加的試驗(yàn)菌落數(shù)，分別測定加入的各試驗(yàn)菌菌液中每mL的菌數(shù)（n=3）。

2.3.3 供試品對照組

測定甲硝唑栓供試液的菌數(shù)，操作同以上的試驗(yàn)組，但不加陽性對照菌（n=3）。

2.3.4 稀釋劑對照組

取試驗(yàn)用的稀釋劑替代供試品溶液測定，操作同以上的試驗(yàn)組（n=3）。

2.4 回收率結(jié)果

試驗(yàn)組菌的回收率（%）=（試驗(yàn)組的平均菌落數(shù)-供試品對照組的平均菌落數(shù)）/菌液組平均菌落數(shù)×100%。稀釋劑對照組菌的回收率（%）=稀釋劑對照組的平均菌落數(shù)/菌液組的平均菌落數(shù)×100%。

結(jié)果判斷：通過3次獨(dú)立平行對甲硝唑栓進(jìn)行微生物限度檢查方法回收率試驗(yàn)，試驗(yàn)組菌回收率和稀釋劑對照組菌回收率均應(yīng)在70%以上。結(jié)果見表1～4。

2.5 控制菌檢查方法驗(yàn)證-金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌

2.5.1 金黃色葡萄球菌

取1?10甲硝唑栓供試液10mL進(jìn)行薄膜過濾，然后用pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗，每次100mL，總沖洗量為1000mL。取出濾膜至胰酪大豆胨肉湯中，同時加入試驗(yàn)菌液1mL，至30～35℃培養(yǎng)18～24h，轉(zhuǎn)培至甘露醇氯化鈉瓊脂平板中，觀察結(jié)果見表5。

2.5.2 銅綠假單胞菌

取1?10甲硝唑栓供試液10mL進(jìn)行薄膜過濾，然后用pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗，每次100mL，總沖洗量為1000mL。取出濾膜至胰酪大豆胨肉湯培養(yǎng)基中，同時加入試驗(yàn)菌液1mL，至30～35℃培養(yǎng)18～24h，轉(zhuǎn)培至溴化十六烷基三甲銨瓊脂平板中，觀察結(jié)果見表6。

2.5.3 白色念珠菌

取1?10甲硝唑栓供試液10mL進(jìn)行薄膜過濾，然后用pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗，每次100mL，總沖洗量為1000mL。取出濾膜至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，同時加入試驗(yàn)菌液1mL，至23～28℃培養(yǎng)48～72h，轉(zhuǎn)培至沙氏葡萄糖瓊脂平板中，觀察結(jié)果見表7。

表5 金黃色葡萄球菌

表6 銅綠假單胞菌

表7 白色念珠菌

3 結(jié) 論

通過3次獨(dú)立的甲硝唑栓微生物限度檢查方法回收率試驗(yàn)，以上的試驗(yàn)結(jié)果可以表明：甲硝唑栓采用薄膜過濾法測定，對（銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌）4株菌種的回收率均在70%以上，符合微生物限度檢查方法適用性測定的可靠性[4，5]。在今后檢測中可采用此方法檢測微生物限度。

[1] 國家藥典委員會.中國藥典(二部)[S]北京:中國醫(yī)藥科技出版,2010:附錄107-116.

[2] 中國藥品生物制品檢定所.中國藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版,2010:351.

[3] 汪穗福.微生物檢測驗(yàn)證技術(shù)[J].中國醫(yī)藥科技出版社,2005:104-107.

[4] 李俊,刑建華,張麗梅.硝酸咪康唑陰道栓微生物限度檢查法[J].醫(yī)藥導(dǎo)報,2009,28(2):253-254.

[5] 苑思坤,李玉芝,王紅云.微生物限度檢查薄膜過濾法供試液預(yù)處理方法探討[J].藥物鑒定,2010,19(18):42-43.

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1671-8194（2013）33-0054-02

*通訊作者：E-mail：fym801120_shh@sina.com.