L.paracasei W2芳香族氨基酸轉氨酶基因克隆與序列分析

唐紅梅，周麗麗，張奇，邵麗麗，王立梅，*

（1.蘇州大學基礎醫學與生物科學學院，江蘇 蘇州 215123；2.常熟理工學院發酵工程技術研究中心，蘇州市食品生物技術重點試驗室，江蘇 常熟 215500）

轉氨酶是一類廣泛存在于生物體內的生物催化劑，能將α-氨基酸中的氨基轉移到α-酮酸分子上，參與許多代謝途徑，包括氨基酸的合成和分解、維生素合成、碳氮吸收、次級代謝等[1-2]。轉氨酶種類很多，其中芳香族氨基酸轉氨酶主要催化苯丙氨酸、酪氨酸、天冬氨酸和亮氨酸的氨基轉移[3]。在乳酸菌等微生物苯丙氨酸代謝途徑中，苯丙氨酸通過轉氨酶的作用形成苯丙酮酸，苯丙酮酸又可在乳酸脫氫酶作用下產生苯乳酸[4-5]。苯乳酸（phenyllactic acid，PLA），是一種新型天然防腐劑，有較廣的抑菌譜，能抑制細菌和真菌的污染，可延長食品的貨架期[6-8]。研究表明PLA 在較低濃度下就可有效抑制大部分食品腐敗菌，特別是其抑制真菌效果要顯著優于一些常用食品防腐劑，如苯甲酸納、山梨酸鉀等合成防腐劑[9]，因此在食品工業中有廣闊的應用前景。

本試驗室篩選到一株可以產生苯乳酸的副干酪乳桿菌（L.paracasei W2）[10]，并對其合成苯乳酸的培養基和培養條件進行了優化[11-12]，然而在野生菌體內的芳香族氨基酸代謝途徑中，芳香族氨基酸生物合成受到調節機制的作用，只是合成自身代謝需要的物質，不會大量產生目的產物苯丙氨酸，因此限制了苯丙氨酸通過轉氨反應形成苯丙酮酸[13]，進而限制了苯乳酸的合成，所以轉氨酶是產苯乳酸途徑中的一種關鍵酶[14]。

本研究從L.paracasei W2 中擴增獲得轉氨酶基因序列（Genbank 登錄號：JX144982），通過生物信息學的方法對轉氨酶基因及其編碼的蛋白結構和性質進行全面的分析，為研究轉氨酶在副干酪乳桿菌產苯乳酸途徑中的生物學功能以及對其進行分子改造從而提高苯乳酸產量提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與載體

副干酪乳桿菌（L.paracasei W2）：由常熟理工學院發酵工程技術研究中心分離并保存；轉化宿主細胞大腸桿菌JM109、克隆載體pMD19-T 購自大連寶生物公司。

1.1.2 培養基及試劑

LB 培養基用于培養大腸桿菌、MRS 培養基用于培養L.paracasei W2。基因組提取試劑盒、DNA 片段純化試劑盒、ExTaq 酶、X-gal、IPTG、Amp、DL2000 Marker均購自大連寶生物公司。引物合成，產物測序由上海生工完成。

1.2 方法

1.2.1 引物設計

根據NCBI 中登錄的Lactobacillus casei str.Zhang芳香族氨基酸轉氨酶基因序列，設計一對引物FP 和RP，擴增轉氨酶基因。

上游引物（FP）：5’-ATGACATTAGTTGATCGGATG AATC-3’

下游引物（RP）：5’-TTAATGCGTTGCCATATACTTGG-3’

1.2.2 基因組DNA 提取及PCR 擴增

利用基因組提取試劑盒提取L.paracasei W2 的基因組DNA，擴增轉氨酶基因，PCR 反應體系（50 μL）包括：10×ExTaq Buffer（Mg2+）5 μL，dNTP Mixture（各2.5 mmol/L）4 μL，上下游引物（10 μmol/L）各2 μL，基因組模板5 μL，ddH2O 31.5 μL，ExTaq 酶0.5 μL。

PCR 反應程序：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性45 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，進行30 個循環，最后72 ℃延伸10 min。反應結束后取10 μL PCR 產物于1%的瓊脂糖凝膠電泳中檢測結果。

1.2.3 重組質粒的構建

第五，巡演類演藝。巡演類演藝指的是在整個景區內進行巡游演出，這種演藝節目大多都出現在大型游樂場等需要和游客實時互動的旅游場合，這類演藝能調節游客在景區的心情，能營造更加強烈的氛圍。

利用DNA 片段純化試劑盒純化PCR 產物，與克隆載體pMD19-T 連接，轉化至大腸桿菌ML09，篩選陽性克隆，菌落PCR 鑒定陽性重組質粒，陽性菌株送至上海生工測序。

1.2.4 序列分析

利用生物信息學軟件對芳香族氨基酸轉氨酶基因序列進行同源性分析，保守結構域分析，蛋白的相對分子質量、等電點等理化性質分析以及二級結構預測，例如Protparam、SOPMA、PROSITE motif search 數據庫，并用其中一些網站對蛋白進行了疏水性分析、跨膜螺旋區分析和磷酸化位點預測等。利用swissmode1 軟件和PyMOL 軟件預測了蛋白質的高級結構。將L.paracasei W2 和其他菌種的轉氨酶進行氨基酸多序列比對，構建分子進化樹。

2 結果與分析

2.1 芳香族氨基酸轉氨酶基因的PCR 擴增

以L.paracasei W2 基因組為模板，用引物FP 和RP 擴增轉氨酶基因，PCR 產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到約1.1 kb 的片段，與Lactobacillus casei str.Zhang 芳香族氨基酸轉氨酶大小一致，如圖1。

圖1 L.paracasei W2 芳香族氨基酸轉氨酶基因Fig.1 Aromatic Aminotransferase Gene of L.paracasei W2

2.2 重組質粒的篩選與鑒定

將PCR 純化產物與pMD19-T 簡易載體連接，轉化至JM109 感受態細胞，進行藍白斑篩選，隨機挑取白斑接種于5 mL LB（100 μg/mL Amp）的培養液中37 ℃、180 r/min 培養過夜。以菌液為模板進行PCR，所得到的片段大小與PCR 片段大小一樣（1 164 bp），視為陽性克隆，菌液送至上海生工測序，結果如圖2。

圖2 菌落PCR 鑒定結果Fig.2 PCR identification result

2.3 轉氨酶基因序列分析

2.3.1 blast 分析結果

利用nucleotide blast 工具對轉氨酶基因序列進行同源性分析，如圖3 所示，L.paracasei W2 的芳香族氨基酸轉氨酶基因序列與L.casei str.zhang 相似性最高為100%，與L.casei BL23、L.casei ATCC 334、L.casei BD-II、L.casei LC2W 相似性達99%。

圖3 blastn 分析結果Fig.3 Result of blastn analyse

2.3.2 rpsblast 分析

rpsblast 分析結果如圖4，從圖中可以看出該轉氨酶有完整的芳香族氨基酸轉氨酶基因保守結構域，另外該基因序列還編碼天冬氨酸轉氨酶及天冬氨酸轉氨酶超家族。

圖4 預測的L.caseiW2 的Aromatic Aminotransferase 保守功能域（標尺代表氨基酸位數）Fig.4 Prediction of conserved domain of Aromatic Aminotransferase from L.paracasei W2

2.3.3 利用EXPASY 中的ProtParam 分析芳香族氨基酸轉氨酶的理化性質

L.paracasei W2 的芳香族氨基酸轉氨酶由387 個氨基酸組成，理論分子量是41 961.2 Da，等電點為6.03。在組成蛋白的20 種氨基酸中，丙氨酸（Ala）所占的比例最高，達到11.9%，而色氨酸（Trp）所占的比例最低，為0.5%。該蛋白在水溶液中在280 nm 處的摩爾消光系數為36 330 M-1cm-1，0.1 %濃度時吸光系數（Abs）為0.866。其成熟N 端為甲硫氨酸時，在哺乳動物網狀紅細胞體外表達的半衰期為30 h，在酵母和大腸埃希菌體內表達的半衰期分別大于20 h 和10 h。脂肪族指數為93.10，在溶液中的不穩定指數為31.28。

2.3.4 信號肽、疏水性、磷酸化位點預測、跨膜螺旋區分析及PROSITE 分析

分析結果顯示轉氨酶沒有信號肽，疏水性較高，有8 個Ser、4 個Thr、6 個Tyr 可能成為蛋白激酶的磷酸化位點，在轉氨酶氨基酸序列的第94～112、119～137位存在兩個跨膜螺旋區。轉氨酶蛋白的功能位點在第233～246 位，氨基酸序列GVSKSHAMTGW RVG，其中K 為催化活性位點。

2.3.5 二級及三級結構預測

圖5 副干酪乳桿菌的轉氨酶二級結構預測Fig.5 Seconday structure prediction of the Aminotransferase from L.paracasei W2

二級結構預測結果如圖5 所示，h 為α 螺旋、e 為延伸鏈、c 為無規卷曲，轉氨酶含α 螺旋、β 折疊和無規卷曲的比例分別為44.96%、9.30%、28.94%，主要以α 螺旋為主。

利用swissmodel 軟件和PyMOL 軟件構建出副干酪乳桿菌（L.paracasei W2）轉氨酶的高級結構，如圖6。

2.3.6 副干酪乳桿菌（L.paracasei W2）Aromatic Aminotransferase 分子進化樹的構建

將副干酪乳桿菌的轉氨酶與其他菌株（Escherichia coli O157：H7 str.Sakai、Lactobacillus plantarum JDM1、Lactobacillus rhamnosus GG、Lactobacillus salivarius UCC118、Lactococcus lactis subsp.lactis Il1403、Listeria monocytogenes serotype 4 b str.F2365、Proteus mirabilis HI4320、Streptococcus oralis Uo5、Lactobacillus casei str.Zhang）的芳香族轉氨酶進行氨基酸序列比對并構建分子進化樹，結果如圖7 所示。

圖6 L.paracasei W2 芳香族氨基酸轉氨酶高級結構Fig.6 Tertiary structure of Aromatic Aminotransferase from L.paracasei W2

圖7 副干酪乳桿菌的Aromatic Aminotransferase 的分子進化樹Fig.7 Phylogenetic tree of Aromatic Aminotransferase from L.paracasei W2

分子進化樹顯示在選擇的菌種中Aromatic Aminotransferase 分為兩大類，而Lactobacillus rhamnosus GG、Lactobacillus casei str.Zhang、L.paracasei W2、Lactococcus lactis subsp.Lactis Il1403、Streptococcus oralis Uo5 起源于同一個分支點，其中L.paracasei W2與Lactobacillus casei str.Zhang 進化關系最近，其次與Streptococcus oralis Uo5、Lactococcus lactis subsp.Lactis Il1403 進化關系較近。

3 結論

在乳酸菌中，苯丙氨酸在轉氨酶的作用下產生苯丙酮酸，苯丙酮酸又可在乳酸脫氫酶的作用下生成苯乳酸，轉氨作用是產生苯乳酸的限速步驟[15]。本試驗擴增得到轉氨酶基因，大小為1 164 bp，與Lactobacillus casei str.Zhang 芳香族氨基酸轉氨酶基因的相似性為100 %，證明L.paracasei W2 中確試存在此轉氨酶基因。

對轉氨酶蛋白的結構與性質進行分析顯示該蛋白無信號肽序列，屬于非分泌型蛋白[16]，第233 位～第246 位是蛋白的功能位點，氨基酸序列為GVSKSHAMTGWRVG，其中K 為輔酶磷酸吡哆醛或磷酸吡哆胺結合位點，輔酶起臨時的氨基載體的作用，通過輔酶在磷酸吡哆醛和磷酸吡哆胺之間的轉換來完成氨基的轉運[17-18]。蛋白序列中有8 個Ser、4 個Thr、6 個Tyr 可能成為蛋白激酶的磷酸化位點。磷酸化是蛋白質合成后廣泛存在的一種化學修飾，是控制酶活性的重要步驟，有利于從分子水平上研究轉氨酶的代謝功能[19]。通過氨基酸序列比對發現在轉氨酶氨基酸序列中有保守的氨基酸位點和保守區域，是轉氨酶酶活性區域，與酶催化活性直接相關。

目前對于大腸桿菌中轉氨酶的研究有較多報道，其天冬氨酸轉氨酶和芳香族氨基酸轉氨酶都能催化苯丙氨酸的轉氨反應，這兩種酶分別由aspC 和tyrB基因編碼[20]。通過序列分析，L.paracasei W2 轉氨酶基因可以編碼芳香族氨基酸轉氨酶和天冬氨酸轉氨酶，是芳香族氨基酸轉氨酶經蛋白水解酶的作用轉變成有活性的天冬氨酸轉氨酶，兩種酶都能催化苯丙氨酸的轉氨作用。這為我們進一步研究轉氨酶的酶學性質以及對其進行分子改造，從而提高L.paracasei W2 產苯乳酸能力提供了理論依據。

[1]Liepman A H,Olsen L J,Genomic analysis of aminotransferases in Arabidopsis thaliana[J].Critical Reviews in Plant Sciences,2004,23(1)：73-89

[2]Mehta P K,Hale T I,Christen P,Aminotransferases：demonstration of homology and division into evolutionary subgroups[J].European Journal of Biochemistry,1993,214(2)：549-561

[3]Yumi Nakai,Hideyuki Hayashi,Hiroyuki Kagamiyama.Cloning and characterization of the tyrB gene from Salmonella typhimurium[J].Biochimica et Biophysica Acta,1996,1308(3)：189-192

[4]Gummalla S,Broadbent J R.Tyrosine and phenylalanine catabolism by Lactobacillus cheese flavor adjuncts[J].Dairy Sci.2001,84(5)：1011-1019

[5]Broadbent J R,Gummalla S,Hughes J E,et al.Overexpression of Lactobacillus casei D -hydroxyisocaproic acid dehydrogenase in cheddar cheese[J].EnViron Microbiol.2004,70(8)：4814-4820

[6]Dieuleveux V,Lemarinier S,Gue'guen M.Antimicrobial spectrum and target site of D-3-phenyllactic acid[J].Int J Food Microbiol 1998,40(3)：177-183

[7]Lavermicocca P,Valerio F,Visconti A.Antifungal activity of phenyllactic acid against molds isolated from bakery products[J].Appl Environ Microbiol 2003,69(1)：634-640

[8]Schnurer J,Magnusson J.Antifungal lactic acid bacteria as biopreservatives[J].Trends Food Sci Technol 2005,16(1)：70-78

[9]Hummel W,Schutte H,Kula MR.Large scale production of Dlactate dehydrogenase for the stereospecific reduction of pyruvate and phenylpyruvate[J].Europen Journal of Applied Microbiology and Biotechnology,1983,18(2)：75-85

[10]王立梅,鄭麗雪.一株乳酸桿菌菌株及其應用：中國,ZL201010207351.1[P].2010-06-23

[11]劉戈,王立梅.Lactobacillus paracasei W2 合成苯乳酸培養條件的優化[J].食品科學,2010,31(23)：174-177

[12]孫姜,鄭麗雪,王立梅.Lactobacillus paracasei W2 產苯乳酸的發酵動力學研究[J].食品科學,2011,32(19)：180-183

[13]Vermeulen N,Ga′nzle MG,Vogel RF.Influence of peptide supply and cosubstrates on phenylalanine metabolism of Lactobacillus sanfranciscensis DSM20451T and Lactobacillus plantarum TMW 1.468[J].J Agric Food Chem,2006,54(11)：3832-3839

[14]Li XF,Jiang B,Pan BL.Biotransformation of phenylpyruvic acid to phenyllactic acid by growing and resting cells of a Lactobacillus sp[J].Biotechnol Lett,2007,29(4)：593-597

[15]李興峰,江波,潘蓓蕾.苯丙氨酸及苯丙酮酸對Lactobacillus sp.SK007 合成苯乳酸的影響[J].過程工程學報,2007,7(6)：1202-1206

[16]葛菁萍,趙曉龍,張嵐,等.副干酪乳桿菌響應調節蛋白基因克隆與序列分析[J].微生物學雜志,2009,29(1)：60-64

[17]Elick S F,Vavara J.A kinetic and equilibrium analysis of the glutamic oxaloacetate transaminase mechanism[J].J Biol Chem,1962,237(7)：2109-2122

[18]Kiick D M,Cook P F.pH studies toward the elucidation of the auxiliary catalyst of pig heart aspartate aminotransferase[J].Biochemistry,1983,22(2)：75-382

[19]王祿山,高培基.生物信息學應用技術[M].北京：化學工業出版社,2007：161-164

[20]Pranav R,Prabhu,Andr′e O,Hudson.Identification and Partial Characterization of an L-Tyrosine Aminotransferase(TAT)from Arabidopsis thaliana[J].Biochemistry research international,2010(2010)：11-12