番石榴葉提取物-槲皮素的抑菌效果

柯昌松，王轟，牟偉麗

（蓬萊京魯漁業有限公司，山東 蓬萊 265609）

槲皮素是番石榴葉提取物，屬于黃酮類化合物。黃酮類化合物具有抗氧化、抗炎、抗菌等廣泛的生理活性，番石榴葉提取物-槲皮素通過拮抗鈣離子通道，使病毒因缺少鈣離子的輔助而不能進入細胞，從而增強機體免疫力，達到抗病毒的目的[1-3]。現在，食品腐敗是食品界非常關注的問題。微生物的侵襲是食品腐敗的主要因素之一，我國每年由于微生物侵襲損失大量糧食。因而在生產加工和儲藏的過程中，防腐劑的使用就顯得尤為重要。但是由于合成的食品添加劑往往有一定的毒副作用，現在人們越來越傾向于選擇天然物質作為食品防腐劑，因而高效的天然食品防腐劑成為食品工業的研究熱點。黃酮類化合物如槲皮素具有抗菌、抗炎、抗氧化特性，在濃度為2.5%時可抑制葡萄球菌和枯草桿菌的生長，可用作食品防腐保鮮劑[4]。根據黃酮類物質具有較強抑菌活性的特點，本試驗以滅菌生理鹽水為對照，研究了番石榴葉提取物-槲皮素黃酮類物質對常見致病細菌的抑制作用，通過濾紙圓片法測抑菌圈的定性實驗和不同濃度番石榴葉提取物液測最低抑菌濃度，初步了解番石榴葉提取物-槲皮素的抑菌情況，為進一步探尋其作為“綠色”防腐劑的提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 培養基及試劑

營養瓊脂、肉湯培養基、滅菌生理鹽水（0.85%）。

1.1.2 菌種

1.1.3 儀器

滅菌鍋、超凈工作臺、培養箱、培養皿、酒精燈、鑷子、接種環、移液槍、打孔機、濾紙片（注：濾紙圓片直徑為2 mm，厚度為1.5 mm 的新華濾紙）。

1.2 實驗方法

1.2.1 番石榴葉提取物-槲皮素的制備

將番石榴葉鮮葉洗凈、曬干，放入烘箱烘烤后粉碎，用石油醚浸泡脫脂3 次，每次24 h，脫脂后的葉子加水約20 倍，煮沸提取二次，在攪拌下緩慢加入石灰水至pH 為8～9，然后加入3%的硼酸，在此pH 條件下煮20 min～30 min；趁熱過濾，殘渣反復過濾3 次，在60 ℃～70 ℃條件下，用濃鹽酸將pH 調為5，酸水液放置24 h，抽濾；用水將沉淀物洗至中性，70 ℃～80 ℃干燥后，然后95%乙醇重結晶，用甲醇做洗脫劑，將提取物的溶液烘干制成干粉，得到槲皮素黃綠色純品（＞90 %）。實驗時以50%乙醇稀釋成不同的濃度。將提取物稱取1.000 0 g 加入10 mL 50%乙醇溶液加塞置4 ℃冰箱浸泡過夜，取出再置80 ℃水浴熱浸4 h，縮成1 g/mL的番石榴葉提取物，置冰箱備用。

1.2.2 菌株的制備

將菌種移接入相對應的試管斜面培養基上，重復接種，記錄接種名稱和日期。細菌置35 ℃～37 ℃恒溫培養箱內培養18 h～24 h，每種菌株取2 支供測試用，其余注明日期。置于0 ℃～4 ℃，冷藏備用。

1.2.3 番石榴葉提取物儲存液制備

番石榴葉提取物儲存液制備，見表1。

以AES算法為例，在設計加解密算法硬件模塊時以分組算法為基礎。將明文按一定長度分組，明文組經過加密運算得到密文組，密文組經過解密運算（加密運算的逆運算）還原成明文組。分組算法分組可使用128、192或256位甚至更高位的密鑰，可對應10、12等輪數[13]。分組算法的示意圖如圖9所示。

表1 番石榴葉提取物的稱量Table 1 The weight of Guava leaf extract

1.2.4 培養基的制備和制備平板

將配置好的培養基，經高壓滅菌后，冷卻至45 ℃，傾注于干熱滅菌培養皿內，每皿15 mg～20 mg。先加1 mL 菌液于營養瓊脂中，讓菌液與營養瓊脂充分搖勻，記錄菌株名稱、濃度和日期。

1.2.5 抑菌圈的測定（濾紙圓片法）[5]

番石榴葉提取物進行濾紙圓片實驗前，先做定性實驗，取經高壓滅菌后置55 ℃～60 ℃烘箱內烘2 h 的濾紙片，分別置于濃度為1 g/mL 槲皮素水溶液中浸泡10 min，用鑷子鑷取濾紙圓片，在瓶壁上瀝去多余的溶液，放入菌液平板上。記錄下菌編號、藥片的濃度編號和日期，細菌平板倒置35 ℃～37 ℃培養18 h～24 h，觀察有無抑菌作用。

將番石榴葉提取液（相當原液1 g/mL 的量）逐步降低濃度，將番石榴葉提取液和等量的雙倍濃度的營養肉湯相混合，稀釋成濃度為500、250、125、62.5 mg/mL。取經高壓滅菌后置55 ℃～60 ℃烘箱內烘2 h 的濾紙片，分別置于番石榴葉提取物溶液中浸泡10 min，用鑷子鑷取濾紙圓片，在瓶壁上瀝去多余的溶液，放入菌液平板上。每種菌涂布3 個平板，每個平板中十字對稱放處理過的4 張濾紙圓片。記錄下菌編號、濾紙片的濃度編號和日期，細菌平板倒置35 ℃～37 ℃培養18 h～24 h；觀察它的抑菌圈直徑，取3 只培養皿連續平行測試3 次，記錄平均值。

1.2.6 最低抑菌濃度的測定

采用平板劃線法[6-7]測定大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、志賀氏菌的最低抑制濃度，在培養基上劃線培養細菌，以有無菌生長為判斷標準，與對照組（菌落生長正常）比較，有肉眼可見菌落者為無抑菌作用；無菌落生長的番石榴葉提取物濃度為番石榴葉提取物的最低抑菌濃度（MIC）。把待測物用乙醇溶解稀釋成500、250、125、62.5 mg/mL，吸取各種濃度溶液1 mL，分別加入直徑8 mm 的培養皿中，每皿加入已融化的培養基9 mL，搖勻，靜置待凝后制成含有待測濃度供試樣品的平板。在培養皿上劃線接種，細菌平板倒置35℃～37 ℃培養18 h～24 h 培養菌落，觀察個培養皿是否長菌及菌落生長情況。每種番石榴葉提取物濃度梯度做一組平行試驗，以完全沒有菌生長的最低濃度為番石榴葉提取物的MIC 值。

表2 番石榴葉提取物的抑菌作用定性實驗結果Table 2 Qualitative experimental result for inhibitory effect of Guava leaf extract

2 結果與分析

番石榴葉提取物的抑菌作用定性實驗結果，見表2。

由表2 影像結果可以看出番石榴葉提取物對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、志賀氏菌都有抑菌效果。

表3 番石榴葉提取物抑菌作用結果Table 3 The result for inhibitory effect of Guava leaf extract

由表3 結果可知，番石榴葉子中的提取物對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、志賀氏菌的抑制作用很明顯，其中對大腸桿菌、沙門氏菌抑制最強，抑菌圈直徑為13.5 mm、18.7 mm，對金黃色葡萄球菌的抑制作用較弱，抑菌圈直徑為10.5 mm。

番石榴葉提取液最低抑菌濃度的測定結果，見表4。

從表4 可以看出：番石榴葉提取液對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、志賀氏菌都有明顯的抑菌作用，當番石榴葉提取液濃度為1.25%時，大腸桿菌、沙門氏菌的生長完全被抑制，培養皿中無菌落生長，當番石榴葉提取液濃度為2.5%時，枯草芽孢桿菌、志賀氏菌的生長完全被抑制。該番石榴葉提取液的最低MIC 值為：大腸桿菌（MIC）1.25%，枯草芽孢桿菌（MIC）2.5%，金黃色葡萄球菌（MIC）5%，沙門氏菌（MIC）1.25%，志賀氏菌（MIC）2.5%。

表4 番石榴葉提取液最低抑菌濃度的測定結果Table 4 Outcome measure for MIC of Guava leaf extract

3 結論與討論

由定性測試結果顯示，番石榴葉提取液各種濃度對供測試細菌如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、志賀氏菌的抑制作用明顯。被抑制的細菌中既有革蘭氏陽性菌，也有革蘭氏陰性菌；既有球菌，也有桿菌；抑菌試驗結果表明，番石榴葉提取液對常見致病菌和腐敗菌具有明顯的抑制作用。其中對沙門氏菌、大腸桿菌抑制效果最強，MIC=1.25%，抑菌圈直徑為18.7 mm、13.5 mm。對金黃色葡萄球菌的抑制作用較弱，MIC=5%，抑菌圈直徑為23.5 mm。番石榴葉提取液作為天然抗氧化、抗菌主要成分之一，其安全性能極高，如將其用在食品中進行防腐，其推廣和應用必將帶來巨大的經濟和社會效益。

[1]陳新謙,金有豫,湯光.新編藥物學[M].15 版.北京：人民衛生出版社,2006：252

[2]李多,鄧述愷,陳思宇.抗菌藥物[J].中國全科醫學,2007,11(8)：656

[3]陳祝群,例槲皮素型超敏遲緩相反應的臨床報告[J].中國醫藥導報,2006,17(3)：70

[4]謝宗萬.全國中草藥匯編(上冊)[M].北京：人民衛生出版社,1996：882

[5]楊履渭,劉秉陽.微生物學及檢驗技術(細菌對藥物敏感試驗)[M].廣州：廣東科技出版社,1992：440-447

[6]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[S].北京：化學工業出版社,2005：附錄Ⅵ

[7]United state Inc.The United states pharmacopeia USP 27.NF22[S].Rockville,MD：United state pharmacopeia,2004：216