Box-Behnken法優化發芽糙米富集γ-氨基丁酸條件研究

韓濤，陳野，紀緒前，鄭曉晨，宋佳，劉環

（天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津 300457）

γ-氨基丁酸（amino butyric acid，GABA）是一種非蛋白質氨基酸，廣泛存在于動植物體中，由L-谷氨酸經谷氨酸脫羧酶催化轉化而來，是一種重要的的抑制性神經遞質[1]。GABA 具有降低血脂、防止肥胖及活化肝、活化腎功能以及改善脂質代謝等功能[2-3]。此外，GABA 還有促進乙醇代謝、促進生長激素分泌的功效[4]，并且對老年癡呆癥（Alzheimer's disease）也具有良好的防治效果[5]。

近年來，糙米及發芽糙米中的GABA 成為了許多研究的焦點。有研究發現，糙米經過發芽處理，GABA含量大幅提高[6]；糙米的發芽過程可以提高谷氨酸脫羧酶活性，抑制丙酮酸轉氨酶和GABA 氨酶活性，從而降低GABA 分解，使GABA 得到積累[7]。隨著日本發芽糙米產品的出現，臺灣地區也開發出了發芽保健米，國內學者就發芽糙米的功能性和生產技術也進行了研究[8-12]。到目前為止，國內尚無完整的富集發芽糙米中GABA 的生產技術的報道。本研究通過控制糙米發芽的相關技術參數，得到富含γ-氨基丁酸的發芽糙米，提高其營養價值和生理功能特性，為糙米和發芽糙米的深加工提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

寧河1 號（粳稻）：天津市津源海米業有限公司；γ-氨基丁酸（GABA）標品（純度＞99%）：SIGMA 公司；乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）：天津市康科德科技有限公司；鄰苯二甲醛（OPA 化學純）：天津市光復精細化工研究所；β-巰基乙醇（純度＞99%）：AMERCO 公司。

1.2 儀器與設備

HPX-250B 型恒溫恒濕培養箱：上海悅豐儀器有限公司；TDL-5-A 型低速臺式大容量離心機：上海安亭科學儀器廠；Agilent-1200 型高效液相色譜儀（附紫外檢測器）、TC-C18 反相色譜柱（4.6 mm×250 mm 5 μm）：AGILENT 公司；0.45 μm 微孔濾膜（有機系）。

1.3 方法

1.3.1 糙米發芽工藝

挑選顆粒飽滿、成熟度高的糙米，蒸餾水清洗3遍，以質量分數0.5%的次氯酸鈉溶液進行浸泡消毒10 min，再用蒸餾水清洗3 遍。然后在不同條件下浸泡、發芽，最后在80 ℃熱水中浸泡10 min 進行滅酶處理，之后55 ℃烘箱干燥，使水分含量降至10%以下。

1.3.2 GABA 的測定

1.3.2.1 HPLC 色譜檢測條件

Agilent TC-C18 反相色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫40 ℃；流動相：1.6 g CH3COONa·3H2O（pH7.2），600 mL；甲醇200 mL；乙腈200 mL；衍生試劑[13]：稱取400 mg OPA，以50 mL 甲醇溶解后加入β-巰基乙醇400 μL。（4 ℃保存）檢測波長338 nm；進樣量20 μL；流速1 mL/min。

1.3.2.2 樣品GABA 的檢測

分別將糙米和發芽糙米樣品粉碎，過40 目標準篩，于雙層密封袋中4 ℃保存。精確稱取1.0 g 米粉樣品，準確加入5 mL 質量分數為5%的三氯乙酸（TCA）溶液，振蕩5 min，40 ℃水浴2 h，水浴后5 000 r/min 離心20 min，取上清液進行OPA 柱前衍生5 min，之后立即過膜，上機檢測。

1.3.2.3 GABA 標準曲線的制作

準確稱取125 mg GABA 標品，用超純水溶解并定容至100 mL，得濃度為1 250 mg/L 標準溶液。再用上述標準溶液配成3.125、6.25、12.5、22.5、32.5、42.5 mg/L 系列濃度的標準溶液，以OPA 柱前衍生后進樣檢測，以峰面積為橫坐標，標準液濃度為縱坐標制成標準曲線。

1.4 方法與設計

1.4.1 單因素試驗

以浸泡溫度、浸泡時間、發芽溫度和發芽時間為試驗考察因素，以GABA 含量為試驗考察指標，做以下單因素試驗：

浸泡溫度：取7 份糙米，每份15 g，分別用50 mL蒸餾水在20、24、28、32、36、40、44 ℃條件下浸泡8 h，取出滅酶，干燥，測定每份樣品的GABA 含量。

浸泡時間：在32 ℃條件下，將150 g 糙米用500 mL蒸餾水浸泡，分別在0、4、8、12、16、20、24、28、32、36 h取出，經滅酶，干燥后，測定樣品GABA 含量。

發芽溫度：用300 mL 蒸餾水將90 g 糙米在32 ℃條件下浸泡8 h，之后分為6 份，分別放入溫度為20、24、28、32、36、40 ℃的培養箱中培養20 h 后，取出滅酶，干燥制樣，得發芽糙米，測定其GABA 含量。

發芽時間：用600 mL 蒸餾水將180 g 糙米在32 ℃條件下浸泡8 h，之后分為12 份，放入溫度為32 ℃的培養箱中進行發芽，分別在8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30 h 后取出，滅酶，干燥，得到12 份不同的發芽糙米，分別測定其GABA 含量。

1.4.2 優化試驗

在單因素試驗基礎上，運用四因素三水平的Box-Behnken 響應面試驗設計方法[14]，以浸泡溫度、浸泡時間、發芽溫度以及發芽時間為研究因素，以發芽糙米GABA 含量為指標。

1.5 數據分析

運用Design-Expert 軟件（Version 8.0.6）對響應面試驗所得數據進行線性回歸和方差分析，模型和因素的顯著性以F 值進行考察（P＜0.05），所有試驗均重復3 次，以干基表示結果。

2 結果與分析

2.1 GABA 的高效液相色譜檢測圖

利用柱前衍生高效液相色譜法測定GABA 標準品和發芽糙米樣品的譜圖如圖1。

由圖1 可知，GABA 與其他氨基酸衍生物分離比較完全，其他雜質對測定基本沒有干擾。

2.2 GABA 標準曲線

以峰面積（×105）為橫坐標，GABA 標品濃度（mg/L）為縱坐標制作標準曲線并進行線性回歸分析，標準曲線見圖2。回歸方程為Y=0.113 5X-0.459 2，R2=0.999 6。

圖1 GABA 的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of standard GABA

圖2 GABA 標準曲線Fig.2 Standard curve of GABA

Y 與X 顯著相關，表明GABA 在該質量濃度范圍內呈良好的線性。

2.2 單因素試驗

2.2.1 浸泡溫度對GABA 含量的影響

為了考察浸泡溫度對GABA 含量的影響，以發芽糙米中的GABA 為指標，選取不同浸泡溫度進行單因素試驗，實驗結果如圖3。

圖3 浸泡溫度對GABA 含量的影響Fig.3 Effect of soaking temperature on GABA content in germinated brown rice

由圖3 可知，20 ℃～32 ℃的區間內，GABA 含量隨溫度的升高而升高，于32 ℃時達到最大值127.64 mg/100 g；32 ℃～44 ℃范圍內，GABA 含量隨著溫度的升高而降低。因此，最佳浸泡溫度確定為32 ℃～36 ℃之間。另外，由于測得的未發芽糙米中GABA 的含量為85.78 mg/100g，因此可以看出，發芽處理可以明顯提高糙米GABA 含量。

2.2.2 浸泡時間對GABA 含量的影響

為了考察浸泡時間對GABA 含量的影響，以發芽糙米中的GABA 為指標，選取不同浸泡時間進行單因素試驗，實驗結果如圖4。

圖4 浸泡時間對GABA 含量的影響Fig.4 Effect of soaking time on GABA content in germinated brown rice

由圖4 可知，20 h 之前，發芽糙米中GABA 含量隨浸泡時間的延長而逐漸增加；浸泡時間20 h 時有最大值100.97 mg/100 g。20 h 后，發芽糙米GABA 含量隨時間的延長而逐漸減少。因此，確定浸泡時間20 h 左右為較佳浸泡時間。

2.2.3 發芽溫度對GABA 含量的影響

為了考察發芽溫度對GABA 含量的影響，以發芽糙米中的GABA 為指標，選取不同發芽溫度進行單因素試驗，實驗結果如圖5。

圖5 發芽溫度對GABA 含量的影響Fig.5 Effect of germination temperature on GABA content in germinated brown rice

由圖5 可知，在32 ℃之前，GABA 含量隨著溫度的升高而逐漸增加，但溫度超過32 ℃后，曲線呈平緩趨勢。40 ℃以后迅速下降，因此，最佳發芽溫度確定為32 ℃左右。

2.2.4 發芽時間對GABA 含量的影響

為了考察發芽時間對GABA 含量的影響，以發芽糙米中的GABA 為指標，選取不同發芽時間進行單因素試驗，實驗結果如圖6。

圖6 發芽時間對GABA 含量的影響Fig.6 Effect of germination time on GABA content in germinated brown rice

由圖6 可知，GABA 含量在8 h～13 h 內隨時間逐漸增加，在13 h～18 h 緩慢增長，在18 h～23 h 時增長迅速，23 h 時 達 到134.97 mg/100 g；28 h 達 到 峰 值135.79 mg/100 g，之后在28 h～43 h 內先降低后升高，并在38 h 時GABA 含量達到又一峰值，但未超過28 h 的峰值，因此，由GABA含量確定最佳發芽時間為23h～28 h。

2.3 響應面設計試驗

根據單因素試驗結果設定浸泡溫度范圍24 ℃～40 ℃，浸泡時間范圍12 h～28 h，發芽溫度范圍28 ℃～40 ℃，發芽時間范圍18 h～33 h，采用Box-Behnken 響應面設計法優化發芽條件[9]。試驗因素水平和編碼見表1 所示，試驗安排及結果如表2，回歸模型的方差分析見表3。

表1 Box-Behnken 響應面設計試驗因素水平和編碼Table 1 Variables and levels in response surface design

2.3.1 二次多項式回歸模型

經分析得到的發芽條件與GABA 含量之間的二次多項式模型為：

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Process variables and levels in response surface central composite design and experimental results

由表3 可以看出，因素X1、X3、X2X4對發芽糙米GABA 含量影響極顯著（P＜0.01），X2、X4、X2X3對萌芽豇豆中GABA 的含量影響顯著（P＜0.05），X1X2、X1X3、X1X4、X3X4對萌芽豇豆中GABA 的含量影響不顯著（P＞0.05）。

2.3.2 兩因素間交互作用

響應面圖及等高線圖見圖7～圖12，各因素及其交互作用對響應值的影響結果可通過該組圖直觀反映出來。等高線的形狀反映了交互作用的強弱，橢圓表示兩兩交互作用顯著，圓形則表示交互作用不顯著[15]。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance for regression model

2.3.2.1 浸泡溫度和浸泡時間的交互作用

由圖7 可以看出，浸泡溫度和浸泡時間的交互作用不顯著，隨浸泡溫度和浸泡時間的增加，GABA 含量有緩慢增加后又降低，浸泡溫度過高，浸泡時間過長都對發芽糙米GABA 富集不利。所以浸泡溫度在33 ℃左右，浸泡時間在20 h 左右，發芽糙米中GABA 的含量最高。

2.3.2.2 浸泡溫度和發芽溫度的交互作用

由圖8 可以看出，浸泡溫度和發芽溫度的交互作用不顯著，隨浸泡溫度和發芽溫度增加，GABA 含量緩慢增加，但是浸泡溫度和發芽溫度過高，GABA 含量下降。所以浸泡溫度在33 ℃左右，發芽溫度34 ℃左右，GABA 含量最高。

2.3.2.3 浸泡溫度和發芽時間的交互作用

由圖9 可知，浸泡溫度和發芽時間的交互作用不顯著，隨著浸泡溫度和發芽時間的增加，GABA 含量緩慢增加后又緩慢降低。浸泡溫度在33 ℃左右，發芽時間在27 h 左右，GABA 含量達到最高。

圖7 浸泡溫度（X1）與浸泡時間（X2）響應面圖和等高線圖Fig.7 Response surface and contour plot showing the interactive effects of soaking temperature and time on GABA content in germinated brown rice

2.3.2.4 浸泡時間和發芽溫度的交互作用

從圖10 可知，浸泡時間和發芽溫度的交互作用顯著。隨著浸泡時間和發芽溫度的增加，GABA 含量增加，但超過一定范圍后GABA 含量下降，變化較為明顯。浸泡時間在20 h 左右，發芽溫度在34 ℃左右，GABA 含量最高。

2.3.2.5 浸泡時間和發芽時間的交互作用

由圖11 可知，浸泡時間和發芽時間的交互作用達極顯著水平，面形變化明顯，隨著浸泡時間和發芽時間的增加，GABA 含量增加。但浸泡時間和發芽時間過長都不利于GABA 積累。浸泡時間在20 h 左右，發芽時間在27 h 左右，有最高GAB A 含量。

2.3.2.6 發芽溫度和發芽時間的交互作用

由圖12 可知，發芽溫度和發芽時間的交互作用不顯著，隨著發芽溫度和發芽時間的增加，GABA 含量緩慢增加后又緩慢降低。發芽溫度在34 ℃左右，發芽時間在27 h 左右，GABA 的含量最高。

圖8 浸泡溫度（X1）與發芽溫度（X3）響應面圖和等高線圖Fig.8 Response surface and contour plot showing the interactive effects of soaking temperature and germination temperature on GABA content in germinated brown rice

圖9 浸泡溫度（X1）與發芽時間（X4）響應面圖和等高線圖Fig.9 Response surface and contour plot showing the interactive effects of soaking temperature and germination time on GABA content in germinated brown rice

圖11 浸泡時間（X2）與發芽時間（X4）響應面圖和等高線圖Fig.11 Response surface and contour plot showing the interactive effects of soaking time and germination temperature on GABA content in germinated brown rice

圖12 發芽溫度（X3）與發芽時間（X4）響應面圖和等高線圖Fig.12 Response surface and contour plot showing the interactive effects of germination time and temperature on GABA content in germinated brown rice

2.3.3 模型的優化與驗證

通過優化分析得到最佳的發芽條件為浸泡溫度34.23 ℃、浸泡時間21.73 h、發芽溫度33.44 ℃、發芽時間26.53 h，發芽糙米中GABA 含量預測值為188.76 mg/100 g，依據實際情況，選擇浸泡溫度34 ℃、浸泡時間21 h、發芽溫度33 ℃和發芽時間26 h 進行驗證試驗，得到GABA 的含量為189.58 mg/100 g，與預測值接近。

3 結論

通過響應面法建立了浸泡溫度、浸泡時間、發芽溫度以及發芽時間四因素的回歸模型：

依據回歸方程與實際情況得最優的工藝參數為浸泡溫度34 ℃、浸泡時間21 h、發芽溫度33 ℃、發芽時間26 h，GABA 的含量達189.58 mg/100 g，與預測值接近，說明了建立的回歸模型能夠很好的預測糙米發芽條件與GABA 含量之間的關系。同時說明了響應面法優化發芽糙米富集GABA 參數的可行性。

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