對乙酰基偶氮羧光度法測定大豆中可溶性蛋白

馮愛青，胡秋孌，侯曉慧

（1.洛陽師范學院生命科學系，河南 洛陽 471022；2.洛陽師范學院化學化工學院，河南 洛陽 471022）

2006 年在上海召開的“中國大豆食品產業圓桌峰會議”提出了發展中國大豆產業，實施“雙蛋白（大豆+牛奶）工程”振興計劃[1]，人們對大豆蛋白的研究與開發倍加重視。大豆是最豐富、最優質的植物蛋白資源，其水溶性蛋白質可以被人體直接吸收利用，因此對大豆水溶性蛋白的研究及測定具有重要意義[2-3]。

國內對大豆水溶性蛋白質的測定主要采用經典的凱氏定氮法，此法操作繁雜，而且測定的是樣品中的含氮量，除了蛋白質組成中的氮外，還包括非蛋白質組成中的其他有機或無機態氮[4-5]。如何科學準確地測定蛋白質含量，是現代食品檢測研究中最活躍的領域之一，也是解決食品安全方面所面臨的重要問題。

蛋白質測定的光譜分析方法有直接紫外光譜法、分光光度法、熒光光度法、共振瑞利散射光譜法等。其中分光光度法具有操作簡便、成本低、靈敏度高、重現性好等優點[6]。研究發現，在pH2.90 的Britton-Robinson緩沖介質中，紫紅色的有機試劑對乙酰基偶氮羧能與蛋白質形成藍色復合物，λmax 669 nm，該波長下的表觀摩爾吸光系數為3.09×105L/（mol·cm），蛋白質在10 μg/mL～100 μg/mL（BSA）范圍內遵循比爾定律，以此建立的蛋白質測定新方法，線性范圍寬，靈敏度高。用于大豆水溶性蛋白的測定，操作簡便，重現性好，基本無干擾，取得滿意結果。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

UV-3010 型紫外可見分光光度計：日本日立公司；pHS-3C 精密pH 計：上海雷磁儀器廠；722 型光柵分光光度計：上海欣茂儀器有限公司；10 mL 具塞比色管。

對乙酰基偶氮羧：上海長科試劑研究所，2.0×10-4mol/L；牛血清白蛋白、人血清白蛋白：BSA、HSA，北京百泰生化技術公司；卵蛋白（OVA）：上海伯奧生物科技公司；溶菌酶（LYS）：上海麗珠東風生物技術有限公司；酪蛋白（CAS）：上海華碩精細化學品有限公司；蛋白質濃度均為1 mg/mL；Britton--Robinson（B-R）緩沖溶液；十二烷基硫酸鈉（SDS），0.1%；TritonX-100（TX-100），1%；溴代十六烷基吡啶（CPB），0.1%；聚乙醇辛基苯基醚（OP），2%。所用試劑均為分析純，試驗用水為二次去離子水。

1.2 方法

于10 mL 具塞比色管中依次加入1.0 mLB-R 緩沖溶液，2.0 mL 對乙酰基偶氮羧溶液，0.5 mLBSA 標準溶液，1.0 mLTX-100 溶液，水稀釋至刻度，搖勻，以相應試劑為參比，用1 cm 比色皿掃描吸收光譜或于669 nm 測定溶液的吸光度。

2 結果與討論

2.1 吸收光譜

吸收光譜如圖1。

圖1 吸收光譜圖（pH2.90）Fig.1 Absorption spectra（pH2.90）

在pH2.90 的B-R 緩沖溶液中，對乙酰基偶氮羧的λmax 為577 nm（a），加入BSA 后，溶液顏色由透明紫紅色變為藍色，在669 nm 處產生最大吸收（b），表明有新的物質生成。從對乙酰基偶氮羧和BSA 在酸性條件下的結構可知，二者主要靠靜電引力形成了復合物，使λmax 紅移約92 nm。在一定濃度范圍內，BSA 濃度與吸光度值呈良好的線性關系，實驗選擇669 nm 作為測定波長。

2.2 緩沖溶液及用量選擇

在不同pH 的緩沖溶液中，測定復合物的吸光度。結果表明：在VB-R=0.5 mL～2.0 mL 的緩沖溶液中，體系穩定，吸光度值最大。實驗用1.0 mL 的B-R 緩沖溶液，控制反應體系的pH 為2.90。

2.3 試劑用量選擇

固定蛋白質的用量，改變對乙酰基偶氮羧的用量，隨著對乙酰基偶氮羧用量的增加，吸光度在不斷的增加，VR=1.8 mL～2.2 mL 時吸光度基本保持不變，實驗取對乙酰基偶氮羧的用量為2.0 mL，CR/CBSA=54∶1。

2.4 反應時間及穩定性

對乙酰基偶氮羧與BSA 反應迅速，室溫下（15 ℃～20 ℃）瞬間達到穩定，1 h 內吸光度保持不變。試驗了30 ℃和35 ℃（水浴）的反應時間及穩定性，結果表明溫度影響不明顯。

2.5 離子強度的影響

加入NaCl 測試了體系的離子強度，結果表明，NaCl 的濃度為0.01 mol/L，體系的吸光度提高7.6%，隨著NaCl 加入量增加，吸光度又逐漸降低，當NaCl 濃度達到0.1 mol/L 吸光度提高7.6%，隨著NaCl 加入量增加，吸光度又逐漸降低，當NaCl 濃度達到0.1 mol/L時，體系吸光度降低50%。離子強度的影響進一步表明對乙酰基偶氮羧與BSA 之間主要是通過靜電作用結合的。

2.6 表面活性劑和有機溶劑的影響

分別試驗了陽離子表面活性劑（CPB），陰離子表面活性劑（SDS），中性表面活性劑（OP、TrittonX-100），無水乙醇對體系吸光度的影響，結果表明：加入CPB、SDS，體系吸光度迅速減小，當CPB 為0.005%時，吸光度減少99.3%，SDS 為0.001%，吸光度減少27.8%；OP 對吸光度影響不大；TrittonX-100 和無水乙醇，使吸光度增加，其中TrittonX-100 加入0.1%，吸光度提高23%。實驗選用0.1%的TrittonX-100。

2.7 精密度

取10 份濃度均為7.35×10-6mol/L 的BSA 溶液，按照試驗方法進行平行測定，吸光度的平均值0.404，RSD0.46%。

2.8 標準曲線

在試驗條件下，研究了對乙酰基偶氮羧與牛血清白蛋白（BSA）、人血清白蛋白（HSA）、卵蛋白（OVA）、溶菌酶（LYS）、酪蛋白（CAS）的響應情況，繪制相應的標準曲線列于表1。

從表1 中結果可知，靈敏度高，線性范圍寬是本方法的突出優點，一向響應較低的卵蛋白也有較高的靈敏度。還具有BSA 和HSA 響應接近、酪蛋白靈敏度更高的特點。

表1 蛋白質的工作曲線Table 1 Calibration curve of proteins

2.9 干擾離子的影響

用本方法對有可能干擾的一些物質，按大豆中各組分物質的實際含量進行測定[7-8]，結果列于表2。

表2 干擾物質的影響Table 2 Interfering of substances

結果表明，大豆中存在的無機離子，產生的誤差均在±5%以內，基本不干擾。

3 樣品測定

樣品制備：準確稱取干豆粉（黃豆，黑豆）1 g 于60 ℃烘干，粉碎，過100 目篩，加溫水10 mL 浸泡30 min，于50 ℃下攪拌50 min，于4 000 r/min 下離心分離。取5 mL上層提取液，加2 mL 四氯化碳，攪拌，離心分離，取上層液1 mL，稀釋50 倍備用。

樣品測定：按照試驗方法，測其結果及回收率見表3。

結果表明，對乙酰基偶氮羧光度法測定豆類中可溶性蛋白含量為：黃豆0.36 mg/mL，黑豆0.38 mg/mL，回收率符合生化分析要求。

表3 樣品中蛋白質測定結果（n=3）Table 3 Assay results of proteins of sample（n=3）

4 結論

在酸性條件下，有機試劑對乙酰基偶氮羧與無色的大豆蛋白及TrittonX-100 形成三元反應體系，生成藍色多元可溶性復合物，該復合物在波長669 nm 處的表觀摩爾吸光系數為3.09×105L/（mol·cm），蛋白質在10 μg/mL～100 μg/mL（BSA）范圍內遵循比爾定律，以此建立了選擇性及靈敏度較高的蛋白質測定新方法，用于大豆中可溶蛋白質的測定，操作簡便，克服了經典方法中測定非蛋白氮的不足，為準確測定大豆水溶性蛋白質提供了一種科學安全的原理和方法。

[1]伊宗倫,王婧,涂順明,等.“雙蛋白工程”與中華民族的強盛[J].中國食品學報,2007,7(1)：1-5

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[3]程莉君,石雪萍,姚惠源.大豆加工利用研究進展[J].大豆科學,2007,26(5)：775-780

[4]盛成樂.關于凱氏定氮法測定蛋白質的幾個問題[J].中國釀造,2002(2)：43-44

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[8]韓立德,蓋鈞鎰,張文明.大豆營養成分研究現狀[J].種子,2003(5)：57-59