交叉引物等溫擴(kuò)增技術(shù)檢測沙門氏菌

祁軍，左峰，劉國紅，劉紅梅，徐高連，張霞，*

（1.天津出入境檢驗檢疫局，天津 300461；2.杭州優(yōu)思達(dá)生物技術(shù)有限公司，浙江 杭州 310053）

沙門氏菌是一種食源性病原菌，為腸桿菌科、腸桿菌屬的一個種[1]，沙門氏菌屬有的專對人類致病，有的只對動物致病，也有對人和動物都致病。沙門氏菌病是指由各種類型沙門氏菌所引起的對人類、家畜以及野生禽獸不同形式的總稱。感染沙門氏菌的人或帶菌者的糞便污染食品，可使人發(fā)生食物中毒[2-4]。據(jù)統(tǒng)計在世界各國的種類細(xì)菌性食物中毒中，沙門氏菌引起的食物中毒常列榜首。我國內(nèi)陸地區(qū)也以沙門氏菌為首位。

國外學(xué)者相繼開發(fā)出多種沙門氏菌的檢測、分離方法。目前國際、國內(nèi)上對于沙門氏菌的檢測方法主要有常規(guī)生化檢測方法、膠體金測試條法、熒光免疫分析法和PCR 法、實(shí)時熒光PCR 法、環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增法等分子生物學(xué)方法[5-7]，鑒于國內(nèi)外對沙門氏菌各種檢測技術(shù)均有深入研究，本研究應(yīng)用一種新的交叉引物等溫擴(kuò)增技術(shù)[8]建立一種既有分子生物學(xué)檢測的高靈敏、高通量，又具有免疫學(xué)檢測的特異性好、操作簡捷，又不需要任何復(fù)雜儀器的快速檢測方法，以適用于基層實(shí)驗室和現(xiàn)場快速篩查檢測。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

dNTPs：Fermentas；10 × Bst buffer：New England Biolabs；Bst DNA polymerase large fragment：New England Biolabs；MgSO4：Sigma；betaine：Sigma；核酸快速檢測試紙條：杭州優(yōu)思達(dá)公司。

菌株采用沙門氏菌19 株，包括4 株CMCC 菌株、來自14 個國家樣品中分離出的野生株及35 株其他相關(guān)陰性菌，詳見表1。

表1 試驗菌株Table 1 Bacterial strains for detection

續(xù)表1 試驗菌株Continue table 1 Bacterial strains for detection

1.2 主要儀器與設(shè)備

PCR 擴(kuò)增儀：Biometra；離心機(jī)：Eppendorf，5417R；DNA/RNA/蛋白分析儀：BHIMUZDA，Bio Specmini。

1.3 方法

1.3.1 DNA 的提取及定量

沙門氏菌CMCC 50041 為試驗菌株，接種于10 mL營養(yǎng)肉湯中，37 ℃培養(yǎng)16 h，取1 mL 用于細(xì)菌基因組提取，利用紫外分光光度計檢測DNA 質(zhì)量及純度。

1.3.2 引物及探針的設(shè)計

利用沙門氏菌特有的序列[10-11]設(shè)計特異性引物及探 針 為：SALMF31：5 -GCGGAAGTCGCGGCCCG；SALMB3：5-TCGCACCGTCAAAGGAACC；SALMCPR1：5 -AGATGAGTATTGATGCCGATTTGTCAGTACGCTTC GCCGTTCGC；SALMDF5F：5-FITC-AGGCCGGTATTA TTGATGC；SALMDF5B2：5-BIOTIN-TTTCTCTGGATG GTATGC。

1.3.3 反應(yīng)體系和反應(yīng)條件

反應(yīng)體系為：10×ThermoPol buffer 2 μL，10 mmol/L dNTP 0.8 μL，100 mmol/L MgSO40.8 μL，5 mol/L Betaine 2 μL，8 U/μL Bst DNA pol 1 μL，20 μmol/L SALMF31/SALMB3 0.1 μL/0.1 μL，10 μmol/L SALMCPR1 0.8 μL，20 μmol/L SALMDF5F/SALMDF5B2 0.8 μL/0.8 μL，模板1 μL，ddH2O 補(bǔ)足至50 μL。

反應(yīng)條件：63 ℃反應(yīng)60 min。

1.3.4 特異性試驗

對表1 中菌株核酸樣本進(jìn)行試驗，以證明檢測方法是否具有通用性及特異性。

1.3.5 靈敏度試驗

通過對提取DNA 進(jìn)行定量、純菌液計數(shù)后10 倍稀釋，按照反應(yīng)體系進(jìn)行試驗，試驗重復(fù)6 次檢測。

1.3.6 實(shí)際樣品檢測

用該研究建立的檢測方法體系與現(xiàn)有國家標(biāo)準(zhǔn)檢測方法同時對來源于不同國家的不同種類食品的127 份實(shí)際樣品進(jìn)行普查檢測，確定該檢測體系的假陽性率及假陰性率，客觀全面分析評估建立的檢測體系可操作性及準(zhǔn)確率。

2 結(jié)果與分析

2.1 特異性試驗

檢測54 株實(shí)驗菌株，其中19 株沙門氏菌檢測全部為陽性，圖1 是部分沙門氏菌檢測結(jié)果；其余35 株陰性相關(guān)菌檢測為陰性，圖2 為部分腸桿菌科其他陰性菌株的試驗結(jié)果，說明該方法特異性良好，而且對于沙門氏菌檢測具有很好的通用性。

圖1 沙門氏菌特異性檢測Fig.1 Specificity of detecting salmonella strains

圖2 非沙門氏菌特異性檢測Fig.2 Specificity of detecting for non-salmonella bacterial strains

2.2 靈敏度試驗

2.2.1 DNA 檢測靈敏度

利用紫外分光光度計檢測CMCC 50041 DNA 純度為1.982，質(zhì)量68.44 μg/mL。用TE 對DNA 原液進(jìn)行10 倍梯度稀釋至10-8，按照反應(yīng)體系進(jìn)行試驗，試驗重復(fù)6 次，結(jié)果見表2，說明該方法DNA 檢測靈敏度可達(dá)到101fg/反應(yīng)。

表2 CMCC 50041 DNA 靈敏度試驗結(jié)果Table 2 Sensitivity of detecting salmonella CMCC 50041 DNA

2.2.2 純菌液靈敏度檢測

沙門氏菌CMCC 50041 過夜菌液計數(shù)為6.0×108CFU/mL，用PBS 對菌液進(jìn)行10 倍梯度稀釋至6.0×100CFU/mL，各取1 mL 提取細(xì)菌基因組做實(shí)驗?zāi)０?，結(jié)果見圖3，靈敏度達(dá)到102CFU/mL。

圖3 沙門氏菌CMCC 50041 菌液靈敏度試驗Fig.3 Sensitivity of detecting salmonella CMCC 50041 in pure culture

2.3 實(shí)際樣品檢測

對127 份實(shí)際樣品進(jìn)行普查檢測，金標(biāo)準(zhǔn)的傳統(tǒng)生化檢測結(jié)果陽性樣品3 個，陰性結(jié)果124 個；該檢測方法陽性結(jié)果5 個，陰性結(jié)果122 個。兩種檢測方法結(jié)果大致相符，新建立的方法沒有漏檢情況，有可能出現(xiàn)假陽性，但發(fā)生率較低。

3 結(jié)論

與傳統(tǒng)檢測手段相比，基因檢測能更快，也能更可靠發(fā)現(xiàn)食品安全隱患。目前得到廣泛應(yīng)用的分子生物學(xué)檢測技術(shù)有PCR、實(shí)時熒光PCR 及環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增法（LAMP），其高度靈敏、高度特異及快速的優(yōu)點(diǎn)使分子生物學(xué)方法得到廣泛使用。

本研究建立的交叉引物恒溫擴(kuò)增技術(shù)檢測沙門氏菌的快速篩選方法，檢測DNA 靈敏度可達(dá)到101fg/反應(yīng)、純菌液靈敏度達(dá)到102CFU/mL 可滿足樣品檢測需求。同時通過對大量實(shí)際樣品檢測，同金標(biāo)準(zhǔn)的檢測結(jié)果大致相符，沒有漏檢情況，有可能出現(xiàn)假陽性，但發(fā)生率較低。實(shí)驗結(jié)果表明，該方法特異性強(qiáng)、靈敏度高，操作簡便，不需要特殊設(shè)備，特別適合于基層實(shí)驗室檢測以及樣品的快速篩選檢測。

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