大豆11S和7S球蛋白提取工藝優化研究

宋佳，陳野，鄭曉晨，韓濤，紀緒前，于翠柳，康凈坤

（天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津 300457）

大豆蛋白具有含量高、氨基酸平衡性好等多種營養性和功能性，在食品工業、化學化工、醫藥業等領域中得到廣泛的應用。大豆蛋白可分為2S、7S、11S 和15S 等4 種組分[1]。11S 組分基本上是單一蛋白質，即大豆11S 球蛋白，分子量為302，000 Da～375，000 Da，約占大豆蛋白總量25%～35%，由6 個不同的亞單位（多肽）組成的非糖蛋白，每個亞單位分別由一個酸性亞基和一個堿性亞基B 通過二硫鍵連接而成；7S 伴球蛋白主要指β-伴球蛋白的α、α′和β 亞基組成分子量約為180，000 Da～210，000 Da 的三聚體共軛型糖蛋白，7S 組分約占大豆蛋白30%～35%，大豆7S 球蛋白約占7S組分的80%[1]。11S 是一種不均勻的蛋白，有復雜的多晶現象，對構成四級結構有重要作用。7S 具有致密折疊的高級結構，含有的巰基和二硫鍵較少，而富含賴氨酸和疏水性氨基酸等[1-2]。

大豆11S 和7S 球蛋白在營養和功能特性方面有明顯的不同，11S 球蛋白冷沉的特性，采用冷沉淀法，利用NaCl 改變蛋白溶液中的離子強度制備11S 球蛋白[3]，此法在分離11S 球蛋白上效果好，但對7S 球蛋白的分離提取方面效果不佳，一般很少采用。11S 球蛋白的等電點為6.4，7S 球蛋白的等電點是pH4.8～4.9。目前主要是根據此原理進行7S 球蛋白和11S 球蛋白的分離[4]。Thanh[5]法分離7S 和11S 組分的方法沿用了很多年，但兩種組分中都有交叉成分[6]。雷繼鵬[7]等用類似原理對兩種球蛋白進行分離，但分離不完全存在交叉成分，且加酸易使蛋白質變性，因此還需進一步完善。Nagano[8]等針對Thanh 法的不足，建立了等電點冷沉法，利用氯化鎂、氯化鈉和硫酸銨等可分級鹽析得到Saios 法，此法操作簡便，但純度較低[6]。陳學玲[9]等比較了Nagano 法、Saio 法與Thanh 法提取分離球蛋白的效果，結果表明Thanh 法提取分離大豆11S球蛋白效果優于Saio 法和Nagano 法，接著對Thanh法進行改進，得出最優提取工藝條件為提取時間2 h、料液比1∶20（g/mL）、提取溫度25 ℃。徐麗萍[10]采用Nagano 法確定最佳工藝參數組合為：酸沉pH6.4、Ca2+濃度40 mmol/L 和冰浴時間5 h，對分離效果影響的重要性次序是：酸沉pH＞Ca2+濃度＞冰浴時間。鄭佳[11]等得出浸提大豆蛋白的最佳工藝參數為磷酸鹽緩沖液濃度為0.02 mol/L、料液比1∶16（g/mL）、浸泡溫度45 ℃、pH 為8.5，可得到最高浸提率89.55%。分離大豆11S球蛋白的最適pH 為6.2，純度達75.76%；分離大豆7S球蛋白的最適pH 為4.7，純度達72.99%。Zi Teng[12]等采用Deak 分離法，對比分析了Ca2+和Mg2+對分離兩種球蛋白的影響，得出最優化的分餾步驟：添加5 mmol/L MgCl2，10 mmol/L NaHSO3和20 mmol/L NaCl，11S 組分在pH5.8 沉淀，接著在調至pH4.5 沉淀7S 組分。

大豆蛋白分離過程影響因素很多，如緩沖液的種類、緩沖液的pH、溫度、離子強度以及還原劑等條件的選擇，在一定程度上決定了兩種球蛋白提取的不完全，本研究通過對關鍵提取條件的優化，研究了不同還原劑濃度，金屬離子及離子強度、pH 對兩種蛋白提取率及提取純度的影響。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

低溫脫脂大豆粉：廊坊市興寶食品有限公司。

氫氧化鈉（分析純）、鹽酸（分析純）、磷酸二氫鈉、亞硫酸氫鈉、無水氯化鈣、氯化鉀：天津市江天化工技術有限公司；磷酸氫二鈉：天津市北方天醫化學試劑廠；低分子量標準蛋白：中科院上海生化研究所。

1.1.2 儀器

TDL-5-A 低速臺式大容量離心機：上海安亭科學儀器廠；DYY-6C 電泳儀電源、DYCZ-24D 型電泳槽：北京市六一儀器廠；HH 數顯恒溫水浴鍋：金壇市金城國勝實驗儀器廠；MODULYOD-230 型冷凍干燥機：美國熱電公司；TG328A 分析天平：上海天平儀器廠；PHS-25 型pH 計：上海今邁儀器儀表公司；FW80 型高速萬能粉碎機：天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 大豆11S 和7S 球蛋白分離流程

采用堿提酸沉法，工藝流程如圖1。

圖1 大豆11S 和7S 球蛋白分離流程Fig.1 The extraction process of soybean 11 s and 7 s globulin

1.2.2 NaHSO3濃度對兩種球蛋白提取率影響

按照分離流程對原料浸提處理，在調節pH 到6.4之前，離心后的浸出液中分別加入0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mmol/L 還原劑NaHSO3（SBS），提取兩種球蛋白。與空白組對照，得出最適SBS 濃度。

1.2.3 金屬離子及酸沉pH 對兩種球蛋白分離效果影響

離心后的浸提液中，按2.2.4 得出的最適濃度加入SBS，再分別加入0、5 mmol/L、10 mmol/L CaCl2和0、5 mmol/L、10 mmol/L KCl，1 mol/L HCl（或NaOH）調節pH，4 ℃冷沉過夜離心分離，沉淀即大豆11S 球蛋白。pH 分別取6.4、6.2、6.0；上清液1 mol/L HCl（或NaOH）調節pH 離心分離，沉淀即7S 球蛋白。pH 分別取4.8、4.6、4.4。冷凍干燥后計算提取率，利用SDS-PAGE 凝膠電泳評定提取純度。

1.2.4 SDS-PAGE 凝膠電泳測定分離效果

SDS-PAGE 采用不連續垂直板狀凝膠電泳，上樣量為15 μL～20 μL，濃縮膠濃度為12%，分離膠濃度為10%。加樣完畢后，接通電源，樣品進膠前電壓調為90 V，樣品中溴酚藍指示劑到達分離膠后，電壓升到120 V，待溴酚藍指示劑達到分離膠端前沿0.5 cm～1 cm 處時即可停止電泳，取出電泳凝膠染色過夜，脫色后對電泳圖譜進行分析。

1.2.5 蛋白質提取率計算公式

2 結果與討論

2.1 還原劑NaHSO3濃度對兩種球蛋白提取率影響

還原劑NaHSO3濃度對兩種球蛋白提取率影響，見圖2。

圖2 還原劑NaHSO3濃度對兩種球蛋白提取率的影響Fig.2 Effect of the concentration of NaHSO3on extraction yield

由圖2 可知，隨著SBS 濃度的增加，大豆11S 球蛋白提取率逐漸升高，SBS 濃度0.08 mmol/L 達到最高，隨著SBS 濃度進一步升高，提取率隨著濃度升高而下降；隨著SBS 濃度增加，大豆7S 球蛋白提取率平緩增加。隨著SBS 濃度升高，11S 球蛋白提取率變化比7S 球蛋白明顯，可能由于11S 球蛋白六對亞基均為一個酸性亞基和一個堿性亞基以一個二硫鍵連接，且各個亞基上還分別含有2 到3 個半胱氨酸和胱氨酸側鏈殘基，11S 球蛋白易發生二硫鍵聚合形成大小不同的聚積體，而7S 球蛋白含半胱氨酸殘基很少，只有α 和α′亞基分別含有一個-SH；SBS 主要作用于大豆蛋白的二硫鍵，導致蛋白聚合物解聚，從而增加蛋白質溶解度，所以適度增加SBS 濃度能破壞二硫鍵聚合，增加大豆11S 和7S 球蛋白之間聚合物的解聚作用，提高蛋白質濃度及溶解度。如果提取液中SBS 濃度不足，蛋白聚合物則不能完全解聚。由圖1 可以看出SBS 濃度0.08 mmol/L 對于大豆7S 球蛋白與11S 球蛋白之間的聚合物具有足夠強的解聚作用。因此選取SBS 濃度為0.08 mmol/L。

2.2 金屬離子及酸沉pH 對兩種球蛋白提取分離效果影響

2.2.1 CaCl2濃度、KCl 濃度對大豆11S 球蛋白提取率的影響

CaCl2濃度、KCl 濃度對大豆11S 球蛋白提取率的影響分別見圖3、圖4。

圖3 CaCl2濃度對大豆11S 球蛋白提取率的影響Fig.3 Effect of the concentration of CaCl2on 11S extraction yield

圖4 KCl 濃度對大豆11S 球蛋白提取率的影響Fig.4 Effect of the concentration of KCl on 11S extraction yieid

由圖3 可知，CaCl2對分餾過程的影響很大程度取決于在第一步沉淀的pH。pH 從6.4～6.2，11S 提取率顯著升高，可能由于隨著pH 下降蛋白質的溶解度急速下降，當pH6.0 時，提取率下降，這是因為更多的自由氫離子與Ca2+競爭蛋白分子中同一結合位點；當CaCl2添加量為5 mmol/L，11S 提取率顯著高于對照組，同時pH6.2 時11S 提取率最高。Zi Teng[12]等,指出Ca2+能增加冷沉蛋白11S 的得率，二價陽離子在pH 6.4 先于7S與11S 聯合在一起，可能是由于表面電荷密度的差異。隨著CaCl2濃度進一步升高到10 mmol/L，11S 球蛋白的提取率降低，有可能是鹽析影響，過量Ca2+導致部分蛋白發生水解或者變性，從而導致提取率又發生下降的趨勢。因此添加5 mmol/L CaCl2，pH6.2 提取11S 球蛋白。

由圖4 可知，三組試驗中pH6.2 時11S 提取率高于其它pH，當KCl 濃度為5 mmol/L 提取率達到最高；隨著濃度進一步升高到10 mmol/L，提取率下降，但是均高于對照組。可能是因為在蛋白浸取液中添加金屬陽離子K+，改變了溶液中的電荷分布，增加了冷沉蛋白的得率，但K+似乎與大豆球蛋白結合能力較弱。對比圖3 可知，pH 6.4～6.0，Ca2+比K+更多的與等效的球蛋白共同沉淀，CaCl2更能有效地提高11S 球蛋白的提取率。這可能是由于Ca2+的離子半徑比K+小，從而Ca2+占據蛋白分子更多的結合位點。

2.2.2 CaCl2濃度、KCl 濃度對大豆11S 球蛋白提取純度的影響

圖5 CaCl2濃度、KCl 濃度對大豆11S 球蛋白提取純度的影響Fig.5 Effect of the concentration of CaCl2and KCl on 11S extraction purity

由圖5 可以看出，當pH6.4～6.2 時11S 酸性亞基和堿性亞基相對含量達到最高，之后隨pH 降低到6.0而降低。經分析，Lane5 的大豆11S 球蛋白純度最高，達到78.3%。KCl 對11S 提取純度的影響沒有CaCl2顯著，這種結果也與圖3、圖4 的結果一致。即：CaCl2濃度5 mmol/L，pH6.2，11S 電泳效果最佳。

2.2.3 CaCl2濃度、KCl 濃度對大豆7S 球蛋白提取率的影響

CaCl2濃度、KCl 濃度對大豆7S 球蛋白提取率的影響，見圖6、圖7。

圖6 CaCl2濃度對大豆7S 球蛋白提取率的影響（第一次沉淀pH6.2）Fig.6 Effect of the concentration of CaCl2on 7S extraction yield（the first precipitation pH value 6.2）

圖7 不同pH 值下KCl 濃度對大豆7S 球蛋白提取率的影響（第一次沉淀pH6.2）Fig.7 Effect of the concentration of KCl on 7S extraction yield（the first precipitation pH value 6.2）

由圖6 可知，三組試驗均表明隨著pH 下降，7S 球蛋白提取率也下降，這種趨勢與11S 球蛋白相反，這種現象似乎與兩種球蛋白在不同pH 的溶解度相一致；當對照組二次沉淀pH4.8，7S 提取率最高；在pH4.8時，隨著CaCl2濃度的增加，7S 球蛋白提取率逐漸降低，這與Zi Teng[12]等研究結論一致，當沉淀劑的濃度增加時，伴球蛋白的產量降低純度增加；在pH4.6 和4.4下，隨著CaCl2濃度的增加，提取率變化不明顯，但是均低于同濃度下pH4.8 時7S 球蛋白提取率。原因可能是大豆蛋白的靜電荷幾乎為零，因此陽離子蛋白間的電荷相互作用可以忽略不計。考慮到在pH4.8 時，對照組與添加5 mmol/L CaCl2的7S 球蛋白提取率相差不顯著，為使11S 和7S 球蛋白相對含量都達到最優，因此二次沉淀pH 為4.8 提取7S 球蛋白。

由圖7 可知，KCl 濃度對二次沉淀階段不同pH 大豆7S 球蛋白提取率影響同圖6 的變化趨勢無顯著差異。三組試驗均表明隨著pH 下降，7S 球蛋白提取率逐漸下降；對照組二次沉淀pH4.8 時，7S 球蛋白提取率最高；pH4.8 時，隨著KCl 濃度的增加，7S 提取率逐漸降低；在pH4.6 和4.4 下，隨著KCl 濃度的增加，7S 提取率變化不顯著，但是均低于同樣濃度下在pH4.8 下的提取率。結合圖6 和7，CaCl2濃度對兩種蛋白提取率的影響比KCl 顯著，這個結果進一步證實了前面的推論：即鉀離子與大豆蛋白的結合能力不如鈣離子強。實驗結果表明：添加CaCl2不僅有利于兩種球蛋白的分離，更有助于增加11S 的提取率。

2.2.4 不同pH 對大豆7S 球蛋白提取純度的影響

圖8 不同pH 對大豆7S 球蛋白提取純度的影響（第一次沉淀pH6.2）Fig.8 Effect of different pH value on 7S extraction purity（the first precipitation pH value 6.2）

由圖8 可以看出，pH4.4～4.8，α、α′和β 亞基相對含量隨pH 的升高而升高。經分析，六條泳道中，Lane3的大豆7S 球蛋白純度最高，達到71.1 %。pH4.8，5 mmol/L KCl 條帶酸性亞基含量較高，導致7S 純度相對較低。因此選擇添加5 mmol/LCaCl2條件下二次沉淀pH 為4.8 的7S 電泳效果最佳。

3 結論

本研究以低溫脫脂大豆粉作為原料提取大豆11S和7S 球蛋白，采用堿提酸沉法進行兩種球蛋白分離，在分離大豆11S 球蛋白前加入濃度為0.08 mmol/L 還原劑SBS 可以增加兩種球蛋白間的解聚作用，從而可以提高兩種球蛋白提取率；研究不同的金屬離子及離子強度對大豆11S 和7S 球蛋白在不同的酸沉pH 下的提取率及提取純度的影響，從而得出提取分離兩種球蛋白的優化方案。結果表明：浸提液離心后添加0.08 mmol/L NaHSO3，再添加5 mmol/L CaCl2，調節pH6.2，4 ℃冷沉過夜，離心分離大豆11S 球蛋白，提取量達到最高值15.5 g，提取率達到82.8%，純度達78.3%；上清液調節pH4.8，離心分離大豆7S 球蛋白，提取量達到最高值13.7 g，提取率達到73.2%，純度達到71.1%。新的優化工藝使大豆11S 和7S 球蛋白樣品在得率和純度上均有較大程度的提高。

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