刺五加水提物的抗急性炎癥及免疫增強(qiáng)作用

王瑞強(qiáng)，常曉強(qiáng)，溫占勇

（石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司歐盟技術(shù)部，石家莊 050035）

刺五加俗稱刺拐棒、刺老鴉子等，為五加科植物刺五加[Acanthopanax Senticosus（Rupr.et Maxim）Harms]的干燥根及根莖，性溫，味甘、微苦，歸脾、肺、心、腎經(jīng)，具有益氣健脾、補(bǔ)腎安神之功效，主要用于脾肺氣虛、體倦乏力、久咳虛喘、腎虛腰膝酸痛、心脾不足、失眠、健忘等病癥[1]。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對其藥理作用進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究，尤其對其增強(qiáng)免疫作用報道較為廣泛。但對其抗炎作用報道較少，尤其對刺五加抗炎及提高免疫的內(nèi)在劑量關(guān)系還鮮為報道。為此，筆者對其抗炎免疫作用進(jìn)行了進(jìn)一步研究，以期為其更好的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 動物 昆明小鼠，雌性，體質(zhì)量（20±2）g；SD大鼠，雌性，體質(zhì)量（200±20）g，均由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物研究所提供。

1.2 藥物 刺五加藥材采自黑龍江林區(qū)。實(shí)驗(yàn)前加9倍水煎煮提取3次，每次2 h，合并提取液，濃縮至含生藥材1.0 kg/L的合劑，置冰箱冷藏室備用。

1.3 試劑 二甲苯（天津市贏達(dá)稀貴化學(xué)試劑廠，批號：1320100143），醋酸地塞米松片（天津力生制藥股份有限公司，批號：H12020122），2，4-二硝基氟苯（DNFB，天津制劑一廠，批號：060518），印度墨汁（Solarbio，批號：18060）。

1.4 CP225D型電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司），754紫外—可見分光光度計（天津市普瑞斯儀器有限公司）。

1.5 統(tǒng)計分析 數(shù)據(jù)采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件處理，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用單因素資料方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 方法及結(jié)果

2.1 刺五加水提物（ASE）對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響[2]取健康昆明小鼠50只，雌性，采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為5組，每組10只，即：生理鹽水組，ASE 低、中、高劑量組（折合生藥材 0.75、1.5、3 g/kg），及地塞米松組（0.01 g/kg）。各組均采用灌胃（ig）給藥，每日1次，連續(xù)5 d。末次給藥45 min后在乙醚麻醉下將100%二甲苯0.1 mL均勻涂在小鼠右耳前后兩面，左耳作對照。1.5 h后將小鼠脫頸處死，沿耳廓基線剪下兩耳，用9 mm直徑打孔器分別在左右耳的同一部位打下圓耳片，電子天平稱重。以兩耳片的質(zhì)量之差作為腫脹度進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)檢驗(yàn)，并計算腫脹抑制率，腫脹抑制率=（正常對照組－給藥組）÷正常對照組×100%。結(jié)果顯示：與生理鹽水組相比，ASE各劑量組均對二甲苯所致小鼠耳腫脹均有明顯抑制作用（P<0.01、P<0.05），且隨劑量增加抑制作用增強(qiáng)，地塞米松陽性對照組對小鼠耳腫脹亦有極強(qiáng)的抑制作用。結(jié)果見表1。

2.2 ASE對蛋清所致大鼠足趾腫脹的影響[3]取健康SD大鼠50只，雌性，隨機(jī)分為5組，每組10只，其余同“2.1”項(xiàng)下給藥。末次給藥1 h后，于每只大鼠左后足趾皮下注射10%雞蛋清液0.1 mL，致炎后1、3、5、7 h分別測定左后足趾厚度1次（用游標(biāo)卡尺測量大鼠踝關(guān)節(jié)下0.5 cm處足趾中央厚度），計算腫脹率，腫脹率=（致炎后足趾厚度－致炎前足趾厚度）÷致炎前足趾厚度×100%。結(jié)果顯示：與生理鹽水組相比，ASE高、中劑量組和陽性對照組對雞蛋清所致大鼠足趾腫脹有明顯抑制作用，并且在3 h時作用最強(qiáng)（P<0.01），低劑量組亦對大鼠足趾腫脹率有降低趨勢，但在7 h的時候差異無統(tǒng)計學(xué)意義，各劑量具有良好的量效關(guān)系。結(jié)果見表2。

表1 ASE對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響（±s）Tab.1 Effects of ASE on the auricular edema induced by xylene in mice（±s）

表1 ASE對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響（±s）Tab.1 Effects of ASE on the auricular edema induced by xylene in mice（±s）

注：與生理鹽水組相比，*P<0.05，**P<0.01。

組別 n 劑量（g/kg） 腫脹度（mg） 腫脹率（%）生理鹽水組 10 - 16.01±2.44** -地塞米松組 10 0.01 7.09±2.10** 55.62**ASE 低劑量組 10 0.75 11.74±4.90** 26.51**ASE 中劑量組 10 1.50 9.90±4.90** 38.03**ASE 高劑量組 10 3.00 7.35±1.63** 53.99**

注：與生理鹽水組相比，**P<0.01。

2.3 ASE對小鼠吞噬功能的影響[4]采用小鼠碳粒廓清實(shí)驗(yàn)觀察了ASE對小鼠網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬功能的影響。取小鼠40只，雌性，隨機(jī)分為4組，每組10只，即：生理鹽水組，ASE低、中、高劑量組（折合生藥材2.5、5、7.5 g/kg）。各組均采用灌胃給藥，每日1次，連續(xù)15 d。末次給藥后，于小鼠尾靜脈注射稀釋5倍的印度墨汁0.1 mL/10 g，分別于注入后1 min及11 min用以肝素預(yù)先處理的微量移液器，自小鼠眼眶后靜脈從取血20 μL，立刻加入到2 mL的0.1%碳酸鈉溶液中，移液器于該液中吸入、吹出數(shù)次以充分洗出吸管壁附著之血液。取血完畢的小鼠斷頸處死，解剖取肝臟及脾臟并分別稱質(zhì)量，以0.1%碳酸鈉液校零，于分光光度計上680 nm處比色，按下式計算吞噬指數(shù)k值，并計算吞噬系數(shù)α值：

式中C為血中炭粒濃度，T為時間，W為體質(zhì)量，WLS為肝脾總質(zhì)量。

結(jié)果顯示：與生理鹽水組相比，ASE各劑量組均能增強(qiáng)小鼠網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬功能（P<0.01和P<0.05），α值差異有統(tǒng)計學(xué)意義，且呈良好的劑量依賴關(guān)系。K值亦有升高的趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果見表3。

表3 ASE對小鼠吞噬功能的影響（±s）Tab.3 Effect of ASE on phagocytic function of monocyte in mice（±s）

表3 ASE對小鼠吞噬功能的影響（±s）Tab.3 Effect of ASE on phagocytic function of monocyte in mice（±s）

注：與生理鹽水組相比，*P<0.05，**P<0.01。

組別 n 劑量（g/kg） 吞噬系數(shù)（α） 吞噬指數(shù)（k）生理鹽水組 10 - 5.02±0.20** 0.256±0.028 ASE 低劑量組 10 2.5 5.30±0.21** 0.257±0.033 ASE 中劑量組 10 5.0 5.82±0.37** 0.274±0.037 ASE 高劑量組 10 7.5 6.37±0.23** 0.282±0.021

2.4 ASE對DNFB誘導(dǎo)的小鼠遲發(fā)超敏反應(yīng)的影響[5]取小鼠40只，雌性，隨機(jī)分為4組，每組10只，其余同“2.3”項(xiàng)下給藥。第7天給藥30 min后，于小鼠腹部去毛處涂0.5%的DNFB 30 μL致敏，末次給藥后于小鼠右耳前后兩面涂0.25%的DNFB進(jìn)行攻擊，16 h后脫頸處死小鼠，沿耳廓基線剪下兩耳，用9 mm直徑打孔器分別在左右耳的同一部位打下圓耳片，電子天平稱質(zhì)量，以右耳的增加質(zhì)量表示遲發(fā)型超敏反應(yīng)的程度。另取胸腺和脾臟稱質(zhì)量，計算臟器系數(shù)。結(jié)果顯示：與生理鹽水組相比，刺五加中、高劑量組能顯著增加小鼠右耳的腫脹程度，提示其超敏反應(yīng)程度顯著升高。此外，刺五加高劑量組能顯著升高小鼠脾臟和胸腺的臟器系數(shù)。上述指標(biāo)均呈現(xiàn)良好的劑量依賴關(guān)系。結(jié)果見表4。

表4 ASE對DNFB致小鼠遲發(fā)超敏反應(yīng)的影響（±s）Tab.4 Effects of ASE on the delayed hypersensitivity induced by DNFB in mice（±s）

表4 ASE對DNFB致小鼠遲發(fā)超敏反應(yīng)的影響（±s）Tab.4 Effects of ASE on the delayed hypersensitivity induced by DNFB in mice（±s）

注：與生理鹽水組相比，*P<0.05，**P<0.01。

臟器系數(shù)（mg/g） 耳質(zhì)量差值（mg）脾臟 胸腺生理鹽水組 10 - 2.98±0.50 1.88±0.41 3.38±1.06 ASE 低劑量組 10 2.5 3.25±0.37 2.16±0.23 3.75±1.33 ASE 中劑量組 10 5.0 3.66±0.29 2.22±0.46 5.50±2.51*ASE 高劑量組 10 7.5 4.66±1.13**2.34±0.37*8.75±1.75**組別 n 劑量（g/kg）

3 討論

炎癥是一種復(fù)雜的機(jī)體自我防御反應(yīng)，其包含了一系列的病理過程，可由病原體感染、抗原抗體反應(yīng)、物理損傷等原因誘發(fā)。炎癥發(fā)生時，早期常伴隨毛細(xì)血管擴(kuò)張及通透性增加，炎癥因子滲出及組織腫脹。小鼠耳廓腫脹模型為一種公認(rèn)的急性炎癥模型，此炎癥過程有多種致炎因子參與，如組胺、5-羥色胺、緩激肽及前列腺素，這些因子可引起血管擴(kuò)張并增加血管通透性，導(dǎo)致管內(nèi)液體成分和細(xì)胞成分滲出到組織間隙，引發(fā)耳腫脹。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：刺五加0.75、1.5、3 g/kg能顯著抑制二甲苯所致的小鼠耳廓腫脹，且呈現(xiàn)良好的劑量依賴關(guān)系。推測其可能通過抑制組胺、5-羥色胺、前列腺素等炎性因子的產(chǎn)生來抑制毛細(xì)血管的擴(kuò)張，降低血管通透性，從而對炎癥起到抑制作用。

大鼠足趾腫脹模型為另一種常用的急性炎性模型，以蛋清作為刺激劑可產(chǎn)生Ⅱ相反應(yīng)，早期主要由組胺、白三烯、血小板活化因子及環(huán)氧化酶參與，后期主要表現(xiàn)為中性白細(xì)胞浸潤、花生四烯酸釋放、自由基產(chǎn)生、及其他嗜中性粒細(xì)胞衍生因子的釋放。上述因子均參與了炎癥的形成，引發(fā)足趾腫脹。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示刺五加能顯著抑制蛋清所致的大鼠足趾腫脹，推測其抑制炎癥的作用可能與抑制組胺、白三烯、環(huán)氧化酶、花生四烯酸等致炎介質(zhì)有關(guān)。

巨噬細(xì)胞是參與免疫反應(yīng)的重要細(xì)胞，主要介導(dǎo)機(jī)體的非特異性免疫。碳粒廓清實(shí)驗(yàn)就是通過測定單核—巨噬細(xì)胞的吞噬功能來反映機(jī)體對外界物質(zhì)刺激的非特異性免疫功能的強(qiáng)弱。遲發(fā)超敏反應(yīng)是由于抗原進(jìn)入機(jī)體后，細(xì)胞在局部接受抗原信息轉(zhuǎn)化為致敏淋巴細(xì)胞。致敏淋巴細(xì)胞再次接觸相同抗原時，釋放出多種免疫因子，如白介素-2（IL-2）、巨噬細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）、干擾素-γ（IFN-γ）[6]。這些因子可加速骨髓單核—巨噬細(xì)胞的增殖和釋放，促使血流中單核細(xì)胞向局部聚集和吞噬抗原。大量吞噬細(xì)胞浸潤抗原接觸部位，可引起組織水腫和組織損傷，導(dǎo)致炎癥，因此可以通過測量皮膚再次受相同抗原刺激后的腫脹厚度來反映細(xì)胞免疫功能的強(qiáng)弱。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：刺五加2.5、5、7.5 g/kg能顯著增加小鼠單核—巨噬細(xì)胞的吞噬功能，并能顯著提高小鼠遲發(fā)超敏反應(yīng)的程度，此外顯著增加了小鼠的脾臟和胸腺的臟器系數(shù)，提示刺五加能增強(qiáng)機(jī)體免疫防御能力，并且這種免疫增強(qiáng)作用與促進(jìn)巨噬細(xì)胞活化有關(guān)。

炎癥和免疫是機(jī)體對異物的兩種不同反應(yīng)是一個問題的兩個側(cè)面，兩者互相重疊，不可分割。對于刺五加的免疫功能，前期已有相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行了探討[7]，筆者在確認(rèn)刺五加的免疫作用的基礎(chǔ)上，對其抗炎作用進(jìn)行了研究。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，刺五加在低于免疫增強(qiáng)作用的劑量下即能產(chǎn)生良好抗急性炎癥的作用，豐富了刺五加的藥理作用，為刺五加的進(jìn)一步開發(fā)提供了依據(jù)。但是對于上述兩方面藥理活性的具體作用機(jī)制，尚需進(jìn)行進(jìn)一步研究。

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