TNF－α增強膀胱上皮細胞清除細胞內肺炎克雷伯桿菌＊

張虎山 路會俠 熊文碧 劉偉 吳琦△

（1.四川大學華西基礎醫學與法醫學院感染免疫研究室，四川 成都610041；2.四川大學華西基礎醫學與法醫學院藥理教研室，四川 成都610041）

上皮細胞是宿主與細菌相互接觸的前沿，除了物理屏障功能，作為宿主防御病原體感染的第一道防線，上皮細胞有復雜的免疫防御及炎癥反應機制。肺炎克雷伯桿菌（Klebsiella pneumoniae，KP）是一種重要的條件致病菌，當機體免疫力低下時，能引起疾病的發生。從泌尿道到呼吸道，肺炎克雷伯桿菌感染的發病率都很高，且在臨床上易反復發作。

吞噬細胞（中性粒細胞、單核／巨噬細胞）在吞噬病原微生物后發生“呼吸爆發”（Respiratory burst），產生大量活性氧（Reactive oxygen species，ROS）或活性氮（RNI），以活性氧或者活性氮破壞微生物核算、蛋白等來殺滅細菌，是重要的殺菌機制［1－2］。細菌進入上皮細胞無論在體外培養細胞模型或體內細菌感染都是重要生物學現象，并與疾病的發生發展密切相關。迄今研究提示，上皮細胞能對抗進入細胞內的細菌，但其中涉及哪些分子機理，仍然缺乏深入探討。本研究以肺炎克雷伯桿菌感染 T24細胞為實驗模型，使用 TNF－α、IFN－γ、IL－1β等重要炎癥細胞因子，初步探討膀胱上皮細胞對抗細胞內細菌的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

肺炎克雷伯桿菌（Klebsiellapneumoniae，KP）編號K5株，為臨床尿路感染分離株，由本實驗室保存。人膀胱上皮細胞株 T24為本實驗室保存。細胞因子 TNF－α、IFN－γ、IL－1β為PeproTech公司產品。1640細胞培養基，非必需氨基酸購自Gibco公司。LB培養基為Oxoid公司產品。胎牛血清購自蘭州民海公司產品。胰蛋白酶購自Merck公司。過氧化氫酶（Catalase CATA），一氧化氮合酶抑制劑（L－NAME），Triton X－100購自Sigma。其余試劑為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養

T24細胞用含10%胎牛血清的1640培養基（無抗生素），37℃5%CO2常規培養。待細胞進入快速生長期，以1.2×105·孔－1接種于 24 孔板，待細胞融合時（約 2.5×105·孔－1）進行實驗。

1.2.2 細菌培養

從LB平板中挑取肺炎克雷伯桿菌K5株單個菌落接種于5ml LB液體培養基，150轉·min－1振蕩培養3h，取100μl菌液鋪于LB固體培養板，倒置于37℃孵箱，培養16h后收集活菌，紫外分光光度計測定650nm OD值確定細菌數量，用RPMI－1640培養基將細菌稀釋到適當濃度。

1.2.3 細菌感染入侵T24細胞

用PBS洗T24細胞三次，每孔加入細菌懸液500μl，細菌數與細胞數的比例為100∶1，每個實驗組為3復孔。讓細菌與T24細胞共孵育2h，采用含慶大霉素（100μg·ml－1）培養基孵育2h殺滅細胞外的細菌，分別在加入細菌后的4、8、18、24h用0.25%Triton X－100裂解細胞，釋放出細胞內的細菌，用平板菌落計數法計算細胞內細菌數量（將裂解液作10倍系列稀釋，每個稀釋樣品涂2個LB平板，置于37℃溫箱中培養，24h后計數菌落）。

1.2.4 細胞因子對T24細胞內活菌數量的影響

K5株細菌與T24細胞共孵育2h，用PBS洗T24細胞三次，加入含有慶大霉素的1640培養基孵育2h殺滅細胞外細菌，然后加入含不同濃度細胞因子（TNF－α、IFN－γ或IL－1β）的新鮮培養基，繼續培養細胞至細菌感染細胞后的24及48h，以Triton X－100裂解細胞，平板菌落計數法確定細胞內細菌數量。

1.2.5 過氧化氫酶（CATA）、L－NAME對細胞因子刺激的抗菌作用的影響

K5株細菌與T24細胞共孵育2h，用PBS洗T24細胞三次，加入含有慶大霉素的RPMI－1640培養基孵育2h殺滅細胞外細菌，然后加入含CATA或L－NAME的培養基預處理細胞1h，再加入同時含細胞因子及抑制劑的培養基繼續培養，于24 h裂解細胞，確定細胞內細菌數量。

1.3 統計學處理

采用SPSS13.0進行統計學處理，數值以±s表示，采用t檢驗。

2 結果

2.1 K5株細菌在T24細胞內的數量動態變化

平板菌落計數結果顯示，K5株細菌進入T24細胞在細胞內生長，以細菌進入細胞后8h胞內活菌數量最多，以后緩慢減少。8、18、24h細胞內活菌數量分別比4h增加36%、34%、22%，見圖1。

圖1 細菌內活菌隨時間變化趨勢

2.2 TNF－α對T24細胞抗菌活性的影響

在細菌進入細胞后，分別以5、10、20ng·ml－1TNF－α作用于細胞。結果顯示，在實驗24h，TNF－α20ng組細胞內活菌數量明顯低于實驗對照組，統計學分析有顯著差異（P＜0.01），TNF－α5ng組、10ng組細胞內活菌數量與對照組相比無顯著差異。在實驗48h，TNF－α10ng、20ng組細胞內活菌數量低于對照組（P＜0.01），5ng組與對照組無顯著差異（P＞0.05）。說明使用TNF－α可以促進膀胱上皮細胞殺滅胞內K5株細菌，并呈濃度依賴關系，見圖2。

圖2 TNF－α對細胞內活菌數量的影響

2.3 聯合使用TNF－α和IFN－α對T24細胞抗菌活性的影響

與空白對照組相比，TNF－α（20ng· ml－1）和INF－γ（20ng·ml－1）聯合使用組在12h、24h、48h細胞內活菌數量分別減少36.1%、74.1%、94.4%。結果說明 使用 TNF－α和INF－γ能更加顯著地促進T24細胞清除胞內的細菌，提示這兩種細胞因子聯合使用可能存在協同效應，見圖3。

圖3 聯合使用TNF－α和IFN－α對T24細胞抗菌活性的影響

2.4 CATA、L－NAME對細胞因子刺激的抗菌作用的影響

實驗24h裂解細胞，平板菌落計數胞內活菌數結果顯示：TNF－α＋INF－γ＋CATA 組與 TNF－α＋INF－γ組比較，24h細胞內活菌數增加了3.16倍，統計學分析有顯著意義（P＜0.01），表明CATA能夠抑制由 TNF－α＋INF－γ刺激產生的T24細胞抗菌活性。L－NAME對細胞因子刺激的抗菌作用無明顯影響。結果見圖4。

圖4 CATA、L－NAME對K5在TNF－α＋INF－γ刺激后的細胞內細菌數量的影響

2.5 IL－1β對T24細胞抗菌作用的影響

在實驗24h，實驗各組之間細胞內的活菌數無明顯差異（P＞0.05）。在實驗48h，IL－1β5ng、10ng組與空白對照組無顯著差異（P＞0.05），IL－1β20ng組比空白對照組細胞內活菌數量有一定程度減少（P＜0.05），說明IL－1β僅在較高濃度（20ng·ml－1）對膀胱上皮細胞抗菌作用有輕微的促進作用，見圖5。

3 討論

早在20世紀60年代，動物實驗顯示，即使把大量的大腸桿菌直接注入豚鼠、大鼠、兔膀胱（甚至有實驗把大腸桿菌注入到人的膀胱），結果并不能造成慢性尿路感染，經過72h，膀胱已清除注入的細菌［3－6］。正常膀胱粘膜究竟是如何清除這些細菌的呢，這是一個值得深究的問題。

近年來研究提示，通過與細菌的直接接觸，或者吞噬攝取細菌，上皮細胞也許有與吞噬細胞同樣重要的抗菌作用。Deitch［7］的實驗顯示與銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌共同培養的腸上皮細胞對這些細菌有很強的殺菌活性（甚至強過中性粒細胞）。Dolapci［8］的研究則展現了口腔粘膜上皮細胞對鏈球菌的抗菌能力。Schulte－Wissermann［9］與 Schofer［10］觀察到大腸埃希菌與正常人尿液中脫落的上皮細胞接觸后死亡，而來自反復尿路感染患者的尿液脫落上皮細胞缺乏類似的抗菌活性。最近，Mulvcy［11］在以小鼠為模型的研究中發現，尿路致病性大腸埃希菌進入膀胱上皮細胞，并可以在細胞內生長，形成細胞內細菌集團（Intracellular bacterial communities，IBC），這個現象可能有助于細菌逃避宿主免疫防御，成為尿路感染容易反復發作的原因。然而注入小鼠膀胱的細菌達到108，在每個膀胱中只觀察到數十個胞內細菌集團，提示膀胱上皮細胞存在抗菌功能，大多數細菌生長被限制。

圖5 IL－1β不同濃度對T24細胞抗菌影響

我們采用臨床分離的肺炎克雷伯桿菌K5株感染T24細胞，發現細菌在T24細胞內早期有一定程度的生長（細菌數量增加一般不超過1倍），以后即逐漸減少。這表明在沒有任何刺激的情況下，膀胱上皮細胞有效限制了胞內細菌的生長，并可能逐漸將它們清除。本試驗結果與Tobias等［12］的報道相似，他們的研究顯示肺炎克雷伯桿菌進入T24細胞后在24h內細菌數量有輕微增加，以后則逐漸減少。

對于上皮細胞限制胞內細菌生長或殺滅胞內細菌的機制，目前所知甚少。Lajarin等［13］發現鼠傷寒沙門菌能在肝細胞內生長，采用 TNF－α、IL－lβ和 LPS聯合刺激后，肝細胞中鼠傷寒沙門菌的生長能力下降。Mellouk等［14］報道IFN－α刺激可以增加肝細胞活性氮（NO）的濃度，從而抑制肝細胞內惡性瘧原蟲的生長。在以血管內皮為模型進行的實驗中，Assis等［15］發現采用TNF－α和IFN－α刺激臍靜脈內皮細胞后，進入細胞的銅綠假單胞菌生長能力顯著下降。

細胞因子對尿路上皮細胞抗菌功能的影響還未見文獻報道。在本文研究中，我們比較系統的觀察了TNF－α、IL－lβ等細胞因子對進入膀胱上皮細胞的肺炎克雷伯桿菌生存的影響，發現單獨使用TNF－α能夠不同程度的促進膀胱上皮細胞抗菌活性，聯合使用TNF－α與IFN－γ能更加顯著地促進T24細胞的抗菌作用。實驗同時發現使用過氧化氫酶（CATA），顯著抑制T24細胞抗菌活性，表明上皮細胞抗菌過程中H2O2起著重要的作用。L－NAME是一氧化氮合酶的抑制劑，本研究顯示LNAME對T24細胞抗菌活性無明顯影響，因此NO可能不涉及膀胱上皮細胞抗菌作用。

與吞噬細胞相似，上皮細胞也可以表達抗菌活性多肽或者蛋白（如β－防御素），但是這些分子是否參與對抗胞內細菌缺乏細胞或動物模型實驗證據。一般認為上皮細胞產生的抗菌肽分泌到粘膜表面形成抗菌生化屏障。IL－lβ可以顯著刺激上皮細胞表達抗菌肽，本研究發現IL－lβ并不能顯著增強T24細胞抗菌功能，提示抗菌活性多肽或蛋白與T24細胞對抗胞內肺炎克雷伯桿菌無關。上皮細胞清除胞內細菌是極為復雜的生物學過程，這中間涉及了細菌對上皮細胞粘附，上皮細胞吞噬（攝取）細菌，上皮細胞天然免疫受體對細菌的識別，細胞內炎癥反應及信號傳遞，功能基因的表達等，值得我們深入探討。

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