hper1基因3′端UTR區雙熒光素酶報告系統構建＊

趙溪巖 成姝婷 勾洵 王正榮 肖靜 郭慧玲 汪宇輝△

（1.四川大學華西基礎醫學與法醫學院生物醫學工程研究室衛生部時間生物學重點實驗室，四川 成都610041；2.四川大學生物治療國家重點實驗室，四川 成都610041；3.四川大學“985工程——創新藥物研究科技創新平臺”，四川 成都610041）

生物體內各個組織器官中均存在周期約為24h的近日節律。近日節律受內在振蕩器－近日鐘控系統調控［1－2］。核心的近日鐘基因有clock，bmal1和per1、2等。其中per1基因，是生物節律分子振蕩系統的重要組成部分［3－4］，在調節生物節律和器官功能方面起重要作用，并與腫瘤細胞增殖［5－6］、抑制［9］及凋亡［7－8］有密切關系。研究發現，microRNA可與3′UTR區結合調控基因表達［10］。Targetscan分析顯示，microRNA138，microRNA24，microRNA29a／b／c可能與hper1基因3′UTR區結合，提示microRNA通過3′UTR區域調控hper1基因轉錄表達。本實驗采用雙熒光素報告酶系統為載體構建hper1基因3′UTR的雙熒光素酶報告系統PMIR－3′UTR，以進一步研究microRNA對hper1基因的調控機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株

A549細胞株來源于四川大學華西醫學中心時間生物學實驗室。

1.1.2 PMIR載體

載體pmiR－RB－REPORTTM購自廣州銳博生物。

1.1.3 主要試劑和儀器

Trizol（Invitrogen），限制性內切酶 XhoI，NotI（TaKaRa），DNA 聚合酶（TaKaRa），PrimeSTAR HS DNA 聚合酶（TaKa－Ra），Fermantas逆轉錄試劑盒，質粒提取試劑盒（天根生化），DNA凝膠純化試劑盒（天根生化），DNA產物純化試劑盒（天根生化），DH5α感受態細胞（天根生化），Lipo2000（Invitrogen）。PCR儀（Bio－RAD），核酸蛋白測定儀（Eppendorf），熒光酶標儀（Synery 4）。

1.1.4 引物

引物由上海生工合成，產物長度為617bp，見表1。

表1 引物序列

1.2 方法

1.2.1hper1基因3′UTR區基因序列分析及引物設計

根據Pubmed Genebank NM＿002616確定hper1基因3′UTR區，設計特異性引物，在上下游引物中加入保護堿基和限制性內切酶XhoI，NotI的酶切位點。

1.2.2 細胞培養

A549細胞用DMEM高糖培養基＋10%胎牛血清培養，在細胞對數生長期進行實驗。

1.2.3 PMIR－3′UTR構建及鑒定

RT－PCR合成序列片段，經雙酶切、純化，與PMIR雙熒光素酶報告載體進行酶連接。將構建PMIR－3′UTR轉染至DH5α感受態細胞，提取PMIR－3′UTR。重組PMIR－3′UTR交北京六合華大基因科技股份有限公司測序。

1.2.4 PMIR－3′UTR熒光素（Luminescence）表達檢測

轉染24h后，熒光酶標儀分別檢測轉染PMIR－3′UTR報告系統與陽性對照載體的熒光（Luminescence）值。

2 結果

2.1 hper1基因3′UTR區域PCR擴增，PMIR載體雙酶切及純化

PCR產物進行1%瓊脂糖電泳分析，特異性擴增條帶清晰明顯（如圖1）。PMIR載體經限制性內切酶Xhol，NotI雙酶切及純化后，特異性條帶清晰明顯（如圖1）。

圖1 hper1基因3′端UTR區PCR產物及PMIR載體酶切純化產物電泳圖

2.2 PMIR－3′UTR雙酶切鑒定

雙熒光素酶報告系統PMIR－3′UTR酶切產物進行1%的瓊脂糖電泳鑒定，得到兩個酶切片段，分別為雙熒光素酶報告載體片段和PCR擴增的hper1基因3′端UTR區片段，結果如圖2：

圖2 PMIR－3′UTR雙酶切電泳圖

2.3 PMIR－3′UTR測序鑒定

雙熒光素酶報告系統PMIR－3′UTR測序結果顯示插入的3′UTR序列正確。

2.4 雙熒光素酶報告系統 PMIR－3′UTR 熒光值（Luminescence）表達

熒光酶標儀測定結果顯示，PMIR－3′UTR雙熒光素酶報告系統與陽性對照報告基因載體分別轉染入A549細胞后，PMIR－3′UTR與和PMIR陽性對照均能在細胞內產生熒光素（Luminescence）表達，見圖3。

圖3 PMIR－3′UTR與陽性對照相對熒光活性比較

3 討論

生物鐘基因調控機制尚不完全清楚，前期對鐘基因的調控主要研究集中在轉錄因子與5′端轉錄調控區結合調控轉錄表達［11－14］。近來研究發現，microRNA可與某些生物鐘基因的3′UTR區結合，調控基因表達［15－18］，從而調控細胞增殖與細胞周期。本文通過擴增hper1基因3′UTR區，連接至雙熒光素酶報告載體中，并檢測PMIR－3′UTR螢光值，證實 PMIR－3′UTR雙熒光素酶報告系統在細胞中可以正常表達。在構建PMIR－3′UTR后，將其與通過生物信息學分析提示可能與其作用的microRNA138，miroRNA24，microRNA29a，microRNA29b 及microRNA29c共轉染入細胞中，繼續探究這些microRNA對hper1基因的調控機制。本實驗成功構建PMIR－3′UTR，以其為平臺來研究microRNA對近日節律核心基因hper1 3′UTR區的調控功能，進一步完善近日節律鐘系統的分子振蕩機制，揭示與節律失調的相關疾病發病機制，為疾病治療提供新的思路。

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