Hg2+、Cr3+對草菇菌絲生長的影響

田艷春，王秀艷

（赤峰學院 生命科學學院，內蒙古 赤峰 024000）

Hg2+、Cr3+對草菇菌絲生長的影響

田艷春，王秀艷

（赤峰學院 生命科學學院，內蒙古 赤峰 024000）

〔目的〕研究Hg2+、Cr3+單一污染對草菇菌絲生長的影響，并測定出草菇對Hg2+、Cr3+的最高耐受濃度.〔方法〕以Hg2+、Cr3+空白為對照，采用平板培養方法研究了Hg2+、Cr3+單一污染對草菇菌絲生長及干重的抑制影響以及草菇對Hg2+、Cr3+的最高耐受濃度.〔結果〕Hg2+、Cr3+在較高濃度條件下,對草菇菌絲生長的抑制作用非常明顯；當Hg2+濃度在0-4mg/L范圍內對草菇菌絲生長及干重的影響不大，當Hg2+濃度在4-16mg/L范圍內對草菇菌絲生長及干重的影響較為明顯；當Cr3+濃度在0-2mg/L范圍內對草菇菌絲生長及干重的影響不大，當Cr3+濃度在2-16mg/L范圍內對草菇菌絲生長及干重抑制作用非常明顯；〔結論〕一定濃度的Hg2+、Cr3+均抑制草菇菌絲生長，使其干重產量降低，本實驗為土壤中Hg2+、Cr3兩種重金屬污染治理提供理論參考.

草菇；汞、鉻離子；菌落直徑；菌落（絲體）干重

草菇〔Volvariellavolvacea(Bull.exFr.)Sing.〕又名蘭花菇、美味包腳菇、中國蘑菇，在分類學上隸屬于真菌門、擔子菌亞門、傘菌目、光柄菇科、草菇屬.草菇菌絲生長溫度范圍為10～42℃，在適溫下生長速度極快，對金屬離子吸收能力較強.

隨著近代工業的迅猛發展，當前全球的環境污染問題日趨嚴重，其中環境污染中的重金屬污染已成為當今世界備受關注的一類公害，重金屬是指比重等于或大于5.0的金屬，如Hg、Cr、Zn、Mn、Cu、Hg、Fe、Ni、As等，過量的重金屬是造成環境污染的重要因素之一，尤其是Hg2+、Cr3+的污染最為嚴重，其中Hg2+可使含巰基的酶喪失活性，失去功能；還能與酶中的氨基、二巰基、羧基、羥基以及細胞內的磷酰基結合，引起相應的損害；Cr3+屬低毒類，有致敏作用，引起類似哮喘的發作，對眼睛、皮膚和粘膜有刺激作用.

而近些年利用大型真菌進行污染環境的生態修復是重金屬污染環境修復研究中一項新的生物技術[1-2].大型真菌在吸收必需的礦質元素的同時，對Hg2+、Cr3+等重金屬元素具有一定的富集或生物轉化作用，從而使土壤和水體中的重金屬得到有效去除[3-4]，食用菌對重金屬污染環境的生態修復功能的前提條件是研究菌絲體和重金屬的相互作用，所以通過研究草菇菌絲對Hg2+、Cr3+污染的耐受濃度以及Hg2+、Cr3+對草菇菌絲生長的影響對環境治理和人類健康均有重要意義.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗菌種

草菇（由江蘇省江都市天達食用菌研究所提供）

1.1.2 試驗儀器

烘干箱、電子天平、高壓滅菌鍋、恒溫培養箱、超凈工作臺、電熱套、打孔器、紗布、培養皿、小燒杯、玻璃棒、燒杯、錐形瓶、量筒.

1.1.3 試驗培養基與藥品

PDA培養基：馬鈴薯煮汁20%、葡萄糖2%、瓊脂粉2%，蒸餾水1000ml

藥品：氯化汞、氯化鉻

1.2 Hg2+、Cr3+濃度設置（如表1）

表1 Hg2+、Cr3+濃度設置

1.3 試驗方法

工藝流程：PDA斜面培養基的制備→試管母種的擴大培養→PDA平板培養→添加刺激因子（Hg2+、Cr3+）的PDA平板培養基的制備→接種→培養→①觀察菌絲長勢②測定菌絲體干重和菌落直徑大小.

1.3.1 PDA斜面培養基的制備及檢測

清洗1000mL燒杯2個、玻璃棒2根、試管10個，烘干.選擇質量較好的馬鈴薯（無病、未出芽、不干縮）洗凈去皮，挖去芽眼，切成長約3cm、寬約3cm、厚約3mm的薄片，稱取100g,加水500mL,煮沸至“酥而不爛”的程度，用6層紗布過濾，定容濾液，再加入瓊脂10g,用小火加熱至瓊脂徹底溶解（加瓊脂的過程中需邊加邊用玻璃棒攪拌），最后加入葡萄糖10g，沸騰使藥品全部溶解.

制備好的培養基趁熱分裝到試管中，一般裝入量為試管總體積的1／5～1／4.分裝時注意勿使培養基黏附在試管口壁上，如有黏附則應用干凈紗布擦凈，分裝好的試管塞上松緊合適普通棉花制備的棉塞.

塞好棉塞的試管用二層報紙包扎好，以免滅菌時水蒸氣浸濕棉塞.然后豎直放入高壓鍋內，滅菌壓力為1.47×105P a，溫度為121℃～126℃，時間30min.

滅菌后，待滅菌鍋內的溫度降到60℃左右取出試管，然后將試管口一端墊起使試管內的培養基斜面約占試管總長度的3/4.

凝固后的PDA培養基，在使用前應進行無菌檢測，將試管培養基置于32±1℃恒溫培養箱中培養3d，如果3d后培養基表面光滑，無雜菌感染方可使用.

1.3.2 二級母種的接種及培養

接種前，將斜面培養基，接種工具，草菇母種（蓋一層報紙，以防紫外線直射引起變異），酒精燈，75%酒精棉球等放入超凈工作臺，封閉進行紫外燈照射消毒半小時，遮光半小時，然后關閉紫外燈，打開吹風機.

首先用75%酒精棉擦拭雙手和草菇母種試管外壁，點燃酒精燈，灼燒接種鏟，然后用左手手掌抓住母種試管和待接種試管，母種管靠外方，用右手拆開報紙并用小拇指和小魚際、小拇指和無名指分別夾住待接種的試管和母種試管的棉塞依次拔出，邊灼燒接種鏟邊慢伸入母種試管中，待溫度降低不致灼傷菌種時，鏟出玉米粒大小的菌塊（注意不要帶太多的培養基），慢慢將接種鏟抽出（注意不要使菌種塊及菌種鏟碰到試管內壁），小心伸入待接種試管培養基中部，菌絲朝上放好慢慢抽出接種鏟，勿碰試管內壁，重復上述操作.

將接完種的試管放在恒溫培養箱內30±1℃黑暗條件下培養7d左右，在培養期間應每天觀察兩次，記錄菌絲萌發時間、定植時間，如有雜菌感染應及時取出，避免污染其它菌種.約7～8天待菌絲長滿試管，挑選菌絲生長健壯、整齊、潔白、濃密、均勻的菌種管作為二級母種，進行下一步試驗.

1.3.3 PDA平板培養基的制備及檢測

按照上述方法制備PDA培養基，分裝到干燥的錐形瓶中，一般裝入量為錐形瓶總體積的1/2，分裝好的錐形瓶塞上棉塞，封上兩層報紙，同時，將清洗干凈并烘干的培養皿用雙層報紙包好，然后與裝有培養基的錐形瓶一起豎直放入高壓鍋內進行滅菌，方法同上.

滅菌結束后取出錐形瓶，在超凈工作臺中倒平板，培養基的倒入量以占培養皿總體積的1/2為宜.

凝固后的平板培養基，在使用前應進行無菌檢測，隨機挑取3-5個平板進行檢測，方法同上.

1.3.4 平板菌種的接種及培養

首先將接種所需物品在超凈工作臺中殺菌30min.

接種時用左手拿平板培養皿和二級母種試管，用右手小拇指和小魚際夾住母種試管的棉塞拔出，灼燒接種鏟晾涼并鏟出蠶豆大小的菌塊接入培養皿中央，菌絲朝上，慢慢抽出接種鏟后，勿碰培養皿壁，重復上述操作.將接好的培養皿放在恒溫培養箱內30±1℃黑暗條件下培養7～8d左右，待菌絲長滿培養皿，挑選菌絲生長健壯、整齊、濃密、均勻的平板菌種進行使用或保藏.

1.3.5 添加Hg2+、Cr3+的PDA平板培養基的制備

制備含氯化汞和氯化鉻分別為0、1、2、4、8mg的PDA培養基各300ml，放入高壓鍋內滅菌3min，滅菌壓力為1.4×105P，溫度為121℃～126℃.

滅菌鍋溫度降到60℃左右，在超凈工作臺中倒平板.

凝固后的平板培養基，在使用前應進行無菌檢測，方法同上.

1.3.6 添加Hg2+、Cr3+的PDA平板培養基的接種與培養

首先將所需物品在超凈工作臺中紫外燈消毒半小時，然后用酒精棉擦拭雙手和菌種試管外壁，點燃酒精燈，灼燒打孔器（φ5mm），晾涼后在菌落均勻區域用打孔器（φ5mm）打取菌餅，菌絲朝上接種于平板中央，以未加測試物的基本培養基作為對照，每個濃度設3次重復，完畢后倒置于30±1℃恒溫培養箱中黑暗培養.

1.3.7 菌落直徑的測定

當對照組菌落長滿培養皿時培養結束，在菌落任一位置測量其直徑，然后逆時針旋轉60°第二次測量其直徑，接著再逆時針旋轉60°進行第三次測量，3個角度測量的平均值為菌落直徑[5].

1.3.8 觀察菌絲長勢并測定菌絲體干重

將各處理的菌絲生長狀況與對照比較,對菌絲疏密程度加以描述[6].最后將培養皿內加入少許水，置于帶有石棉網的電熱爐上加熱,待瓊脂徹底融化后,取出菌絲體,立即用80℃的去離子水沖洗3次收集菌絲.將收集的菌絲放入烘箱內60℃烘至恒重，然后用電子秤稱其干重[4].

2 結果與分析

2.1 不同濃度的Hg2+、Cr3+對草菇菌絲長勢的影響

2.1.1 在不同濃度的Hg2+污染下草菇菌絲長勢均受到不同程度影響

由表2可見，單一Hg2+污染脅迫下,隨著Hg2+濃度的升高草菇菌絲生長速度逐漸減慢、密度逐漸減小、長勢減弱、菌絲量減少.實驗結果如圖1所示.

2.1.2 在不同濃度的Cr3+污染下,草菇菌絲生長均受到不同程度影響

由表3可見，單一Cr3+污染脅迫下,隨著Cr3+濃度的增大,草菇菌絲生長速度減慢、密度逐漸減小、長勢減弱.實驗結果如圖2所示.

表2 Hg2+污染對草菇菌絲長勢的影響

2.2 不同濃度的Hg2+、Cr3+對草菇菌落直徑的影響

表3 Cr3+污染對草菇菌絲長勢的影響

圖1 不同濃度的Hg2+對草菇菌絲長勢的影響

圖2 Cr3+污染對草菇菌絲長勢的影響

2.2.1 不同濃度的Hg2+污染對草菇菌落直徑的影響

由圖3分析可知，單一Hg2+污染脅迫下,隨著Hg2+濃度的逐漸增大,草菇菌落直徑逐漸減小.草菇菌絲在Hg2+濃度為0-16mg/L的范圍內均抑制生長，在該濃度范圍內隨著Hg2濃度的升高菌落直徑減小，二者呈負相關.當Hg2+濃度在0-4mg/L之間時，對菌絲生長抑制作用較弱，濃度在4-16mg/L之間時，對菌絲生長抑制作用較明顯，且在濃度為16mg/L時草菇菌落直徑最小，菌絲長勢最差，菌絲密度最稀疏，因此草菇菌絲對Hg2+的最大耐受濃度為16mg/L.

2.2.2 不同濃度的Cr3+污染對草菇菌落直徑的影響

圖3 不同濃度的Hg2+對草菇菌落直徑的影響

由圖4分析可知，單一Cr3+污染脅迫下,隨著Cr3+濃度的逐漸增大,草菇菌落直徑逐漸減小.草菇菌絲在Cr3+濃度為0-16mg/L的范圍均能生長，但在該濃度范圍內隨著Cr3+濃度的增加菌落直徑逐漸減小，二者呈負相關.當Cr3+濃度在0-2mg/L之間時，對菌絲生長抑制作用較弱，當Cr3+濃度在2-16mg/L之間時，對菌絲生長抑制作用最為明顯，且在濃度為16mg/L時抑制作用最強，草菇菌落直徑最小，菌絲長勢最差，菌絲最稀疏，因此草菇菌絲對Hg2+的最大耐受濃度為16mg/L.

圖4 不同濃度的Cr3+對草菇菌落直徑的影響

2.3 不同濃度的Hg2+、Cr3+污染對草菇菌絲體干重的影響

2.3.1 不同濃度的Hg2+污對染草菇菌絲體干重的影響

圖5 不同濃度的Hg2+對草菇菌絲體干重的影響

在不同濃度的Hg2+污染下,草菇菌絲體干重均受到不同程度影響.由圖5分析可知，單一Hg2+污染脅迫下,隨著Hg2+濃度的逐漸增大,草菇菌落干重逐漸減小.草菇菌絲在Hg2+濃度為0-16mg/L的范圍內雖然受到不同程度的抑制，但是均能生長，在該濃度范圍內，隨著Hg2+濃度的升高菌絲體干重逐漸降低，二者呈負相關，當Hg2+濃度在0-2mg/L之間時對干重影響較小，當Hg2+濃度在2-16mg/L之間時對干重影響最為明顯，且在濃度為16mg/L時，菌絲體長勢最差，菌絲最稀疏，菌絲體干重最輕.

2.3.2 不同濃度的Cr3+污染對草菇菌絲體干重的影響

圖6 不同濃度的Cr3+對草菇菌絲體干重的影響

在不同濃度的Cr3+污染下,草菇菌絲體干重均受到不同程度影響，由圖6分析可知，單一Cr3+污染脅迫下隨著Cr3+濃度的逐漸增大,草菇菌絲體干重逐漸的減小.在Cr3+濃度為0-16mg/L的范圍內雖然受到不同程度的抑制，但是均能生長，隨著Cr3+濃度的增加菌絲體干重逐漸降低，二者呈負相關，當Cr3+濃度在0-4mg/L之間時，對菌絲生長抑制作用較弱，當Cr2+濃度在4-16mg/L之間時對干重的影響較為明顯，且在濃度為16mg/L時，菌絲體長勢最差，菌絲最稀疏，菌絲體干重最輕.

2.3.3 不同濃度的Hg2+、Cr3+污染對草菇菌絲菌落直徑的影響

圖7 不同濃度的Hg2+、Cr3+污染對草菇菌落直徑的影響

由圖7分析可知，不同濃度的Hg2+、Cr3+對菌落直徑的影響圖示趨勢基本一致.即隨著兩種重金屬濃度的增加草菇菌落直徑逐漸減小，當二者濃度在0-2mg/L之間時，對草菇菌落直徑抑制作用較弱，當二者濃度在2-16mg/L之間時對菌落直徑抑制作用較強，而且Hg2+濃度在4-16mg/L之間時抑制作用最為明顯，但二者均在Hg2+、Cr3+濃度為16mg/L時菌落直徑達到最小值.從圖中還可以看出，Hg2+對草菇菌落的生長抑制作用強于Cr3+.

2.3.4 不同濃度的Hg2+、Cr3+污染對草菇菌絲體干重影響的比較

由圖8分析可知，不同濃度的Hg2+、Cr3+對菌絲體干重的影響圖示趨勢基本一致.都是隨著兩種重金屬離子濃度的增加草菇菌絲體干重逐漸減小，差別在于，當Hg 2+濃度為0-2mg/L范圍內時對菌絲體干重抑制作用較弱，當Hg2+濃度2-16mg/L范圍內時抑制作用較強；而當Cr3+濃度為0-4mg/L范圍內對草菇菌絲體干重抑制作用較弱，當Cr3+濃度為4-16mg/L范圍內時抑制作用較強，但二者均在Hg2+、Cr3+濃度為16mg/L時達到最小值.

圖8 不同濃度的Hg2+、Cr3+污染對草菇菌絲體干重的影響

3 結論

3.1 在PDA平板培養基中加入不同濃度的Hg2+、Cr3+對草菇菌絲生長均有不同程度的抑制作用.

3.2 當PDA平板培養基中Hg2+、Cr3+的濃度為16mg/L時，草菇菌絲體干重和菌落直徑均為最小值，即草菇對Hg2+、Cr3+污染的最高耐受濃度均為16mg/L.

3.3 Hg2+、Cr3+濃度在0-16mg/L范圍內與草菇菌絲體干重和菌落直徑均呈負相關，即隨Hg2+、Cr3+濃度的升高，草菇菌絲體干重和菌落直徑均減小.

3.4 Hg2+、Cr3+濃度在0-16mg/L范圍內，總體上看Hg2+較Cr3+對草菇菌絲體干重和菌落直徑的影響較大.

由以上分析可知，影響草菇菌絲體干重和菌落直徑的是PDA平板培養基中Hg2+、Cr3+的濃度大小，當Hg2+、Cr3+的濃度在0-16mg/L之間變動時，兩種重金屬離子的濃度與草菇菌絲體干重和菌落直徑均呈負相關，且Hg2+、Cr3+的濃度在16mg/L時菌絲體干重和菌落直徑均達到最小值，但二者的影響程度不同，而草菇對二者有一定的耐受能力，最大耐受濃度為16mg/L.

希冀此研究成果為重金屬污染環境的生態修復開辟新思路提供理論和試驗依據，從而進一步提高人類健康水平.

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