2型神經纖維瘤病標本庫的建立及應用分析

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2型神經纖維瘤病標本庫的建立及應用分析

趙賦1張晶1王振民2渠沛然2楊智君2王博2劉丕楠1,2★

目的初步建立2型神經纖維瘤病（NF2）患者的標本庫，分析其臨床應用及遺傳學研究的價值。方法收集NF2患者病例資料并進行長期跟蹤隨訪，繪制家族系譜圖并建立信息資料庫；采集NF2患者及家族高危成員外周靜脈血，分離血漿、血清及淋巴細胞分別保存；術中獲取新鮮腫瘤組織15 min內存入液氮中，部分組織制作成石蠟標本；提取腫瘤及淋巴細胞標本中的DNA，質檢并保存，采用PCR-DNA測序方法進行NF2基因突變分析。結果已將293例患者信息納入資料庫，并完成定期隨訪；收集腫瘤冰凍標本72例，腫瘤石蠟標本275例，血液樣本80例；外周血及冰凍腫瘤組織提取DNA的OD260/280值在1.80～1.86之間，198例石蠟樣本提取的DNA片段長度主要分布在1700～2500 bp之間，能滿足分子遺傳學研究的需要。結論NF2標本庫的建立可為癥狀前基因篩查、遺傳規律分析及發病機制研究提供標本來源。

2型神經纖維瘤病；標本庫；分子遺傳學

2型神經纖維瘤?。╪eurofibromatosis 2，NF2）是一種常染色體顯性遺傳病，主要表現為以中樞神經系統腫瘤為主的全身多發腫瘤綜合征，臨床治療困難[1]。隨著我院臨床就診患者數量的不斷增加，迫切需要建立完善的標本庫，為NF2早期篩查、臨床治療及發病機制的研究提供資料和標本。因此，本文將探討如何建立NF2標本庫，現報道如下。

1 資料和方法

1.1 標本來源

收集2000年1月至2008年4月間，北京天壇醫院和北京市神經外科研究所治療的NF2患者病例資料和腫瘤石蠟標本；自2008年5月至今，采集北京天壇醫院診治NF2患者的臨床資料、腫瘤和血液樣本，以及家庭高危成員的信息資料和血液樣本。

1.2 主要設備和試劑

液氮儲存罐（Cryosystem 4000，美國MVE）；-80℃低溫冰箱（MDF-U4186S，日本三洋）；高速臺式冷凍型離心機（Primo R，德國Heraeus）；L500低速自動平衡離心機（北京京立離心機儀器有限公司）；紫外分光光度儀（Pharmacia Biotech Uhrospec 3000）；安捷倫2100生物分析儀（Agilent 2100 DNA 7500，美國安捷倫科技有限公司）；紅細胞裂解液購自北京塞馳生物科技有限公司；Promega公司的基因組DNA 純化試劑盒（Wizard?Genomic DNA Purification Kit）和石蠟樣本基因組DNA小提系統（ReliaPrep? FFPE gDNAMiniprep System）。

1.3 標本取材和保存方法

1.3.1 血液標本的采集、處理及保存

采血前征得患者同意，簽署標本采集知情同意書。真空采血管采集10 mL外周靜脈血，其中6 mL為EDTA抗凝，4 mL不抗凝。非抗凝血室溫靜置 后，3000 r/min離心5 min，吸取上層血清分裝入離心管中?？鼓懿裳箢嵉够靹?次，室溫靜置30 min后，3000 r/min離心5 min，吸取上層血漿分裝入離心管中；下層細胞沉淀移至15 mL離心管內，加入10～12 mL紅細胞裂解液，室溫孵育10 min，1000 r/min離心10 min，棄上層紅色清液。用生理鹽水輕輕吹打沖洗所留取沉淀物3次，1000 r/min離心3 min，棄去上清液，重復2～3遍，收集白色沉淀即為淋巴細胞。全部操作均在無菌條件下進行，血清和血漿保存于-80℃冰箱內，淋巴細胞保存于液氮內。

1.3.2 新鮮腫瘤標本的采集與保存

手術過程中獲取新鮮腫瘤組織，在無菌條件下取無燒灼、無壞死的腫瘤組織，用生理鹽水將血液沖洗干凈后，取1/3腫瘤組織修剪成直徑為0.5 cm小塊3～5份，放入帶標簽的凍存管中，新鮮組織需在離體后15 min內放入液氮內。其余2/3放入3.8%多聚甲醛固定液用于病理檢查。

1.3.3 石蠟標本的采集

標本經固定后常規取材、脫水、包埋，制作成石蠟標本，對其進行切片、HE及免疫組化染色，確定腫瘤組織性質。詳細記錄病理學結果，取剩余樣本制作成石蠟標本保存于標本庫中。

1.3.4 DNA的純化與保存

取部分裂解后淋巴細胞，用渦旋振蕩器劇烈混勻直至重懸；冰凍腫瘤組織用研缽研槌研磨，待液氮揮發后取10～20 mg腫瘤組織，采用Promega公司Wizard?Genomic DNA Purification Kit試劑盒淋巴細胞及冰凍組織提取基因組DNA說明提取上述基因組DNA。取10～20 mg石蠟組織切片，采用FFPE gDNA小提系統常規脫蠟后提取組織DNA。取1μL樣本用分光光度計進行DNA純度鑒定，并用Aglient2100生物分析儀檢測DNA的完整性，所有提取DNA均保存在-20℃冰箱中。

1.4 資料信息化管理

將患者病歷資料、隨訪記錄、遺傳學信息及標本存放等四部分內容進行信息化管理。①自行設計和開發一套資料管理操作系統應用于病歷資料管理，病歷資料包括：基本信息表、病史特點、影像學特點以及家族史等內容；②隨訪記錄包括：患者病情進展、長期治療經過、復查癥狀和體征變化等信息，同時建立家庭高危成員長期隨訪記錄表，以便在其癥狀出現前進行臨床干預；③遺傳學信息包括：患者NF2基因突變類型和位點，相關家庭高危成員進行基因檢測的篩查結果，并繪制家族系譜圖；④標本按家系分別存放，存放信息包括：患者入庫編號、入庫時間、標本類型及數量、存放位置等。

1.5 分析方法

采用Primer 6.0設計引物并用PCR儀進行擴增，產物DNA經回收純化，用DNA分析儀進行雙向測序，對22q12上NF2基因序列進行測序分析。

2 結果

已收集和整理386例NF2病例資料，其中門診或電話跟蹤隨訪293例，建立隨訪記錄并納入患者信息庫。信息庫中包括男性156例，女性137例，患者發病年齡在7～71歲之間，平均為30.5歲；家族遺傳性患者76例，相關家庭高危成員103例，其中10歲以下兒童42例，上述患者均繪制家族系譜圖（圖1）。

圖1 一例三代家族遺傳性NF2患者的家族系譜圖Figure 1 Family tree of inherited patients of NF2

目前，已保存各類腫瘤石蠟標本275例、冰凍標本72例，患者外周血液標本80例，制定合理的標本采集流程規范，初步建立起包含血清、血漿及淋巴細胞標本、冰凍及石蠟腫瘤標本和DNA標本的NF2腫瘤標本庫。從血液、冰凍組織樣本中提取DNA并進行質檢，OD260/280比值分別為1.85和1.80～1.86之間；198例石蠟樣本DNA片段長度主要分布在1700～2500 bp之間（圖2）。

對標本庫保存的樣本進行NF2基因的測序，包括27例石蠟標本、15例冰凍標本和12例血液樣本，在外顯子序列中共發現出51個位點發生突變，5例散發患者存在體細胞鑲嵌現象（圖3）；對14例家庭高危成員血液標本進行篩查，6例發現遺傳位點存在基因突變（圖4）。結果顯示：標本庫采集并存放的各類樣本，可進一步用于NF2相關的分子遺傳學研究。

3 討論

隨著分子生物學技術的不斷提高，使得人們對腫瘤的發生和發展能有更深入的認識。而建立完善的標本庫能更規范和高效地利用腫瘤標本，從而進行多個領域的研究。對于NF2這類少見的遺傳性疾病來說，進行基因水平的研究，不僅可揭示腫瘤的形成機制和相關功能基因特征，而且可用以指導疾病早期診斷及靶向治療。目前已明確NF2是由常染色體22q12上的NF2抑癌基因突變引起的，其編碼的Merlin蛋白功能異常或缺乏時將引起腫瘤生長。但NF2基因突變的規律及Merlin蛋白的功能尚未得以完全闡明[2]，且疾病相關研究的進展緩慢。原因可能是由于NF2發病率低且分布散在，未能形成大規模的病例資料統計和完善的腫瘤標本庫造成的。目前，全世界僅英國曼徹斯特的圣瑪麗醫院建立了較大規模的NF2標本庫，并據此開展了一系列研究[3]。由于NF2突變可能因種族或地域的不同存在一定的差異性，因此，建立我國NF2患者的標本庫，將為研究NF2發生機理和遺傳規律起到重要作用。此外，在散發的聽神經瘤、腦膜瘤和室管膜瘤中也發現存在NF2基因突變[4]，采集腫瘤標本也將有助于進一步揭示NF2基因在腦腫瘤中的作用機制。

圖2 石蠟標本DNA質檢結果Figure 2 DNA quality control results of FFPE samples

圖3 一例散發NF2患者測序圖Figure 3 Sequencing results of a sporadic patient of NF2

圖4 一例家系遺傳NF2患者的DNA測序圖Figure 4 Sequencing results of a inherited patient of NF2

由于NF2為常染色體顯性遺傳病，患者約有50%的概率將突變傳給下一代。隨著診斷及治療水平的不斷提高，我國將有越來越多的患者得到及時地治療，患者年齡也將更加年輕化。但NF2發病方式多樣化，目前確診標準仍以臨床表現為依據，不能進行有效地早期干預。因此，開展基因學分析特別是針對家族性病例，能更有效地開展治療和指導性服務，包括治療方案的確立、早期家庭的臨床護理、計劃生育咨詢和產前診斷等。當受累患者確定存在某個突變時，應采集家庭高危成員的血液標本，提取DNA并進行NF2基因突變檢測?？刹捎没驕y序技術聯合多重連接探針擴增技術（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA），對NF2基因所有外顯子進行基因序列分析，其檢測的敏感度達91～95%[5]。由于新發的NF2患者可能存在體細胞鑲嵌現象，可將血液及腫瘤樣本共同檢測，才能更好的確定突變。對于兒童進行癥狀前檢測的最佳時機仍存在爭議[6]，但盡早確診能讓患者及家庭成員做好各方面準備，從而進行疾病的監測和治療。家族遺傳的病例應詳細繪制家族系譜圖，并以家系為單位存放資料和各個標本，為NF2遺傳規律的研究和長期家庭治療打下基礎。

要建立一個符合國際標準的NF2腫瘤標本庫，規范化的標本采集、保存及使用是必要的，應由專人負責管理和登記。由于NF2患者都需要接受多次治療，應詳細記錄治療經過并建立完善的信息資料庫，為后續治療提供指導和幫助。如果患者選擇在當地醫療機構進行手術治療，通常不能獲取高質量的凍存組織標本，石蠟標本同樣可以作為較好的研究對象。石蠟樣本提取DNA的質量能夠較好地滿足PCR反應和基因測序要求，有研究顯示[7]石蠟樣本可用于開展芯片技術和RNA的分析。標本的良好運用也將為臨床治療提供更多新的思路，Plotkin報道了[8]根據NF2聽神經鞘瘤石蠟樣本免疫組化結果，嘗試用貝伐單抗進行藥物治療，有效地減小了聽神經瘤體積。因此，在建立NF2完善的腫瘤標本庫基礎上，應進行合理地開發和利用，有望盡早發現在基因水平上阻斷NF2腫瘤發生的新方法。

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Establishment and analysis of neurofibromatosis type 2 bank for research

ZHAO Fu1, ZHANG Jing1, WANG Zhenmin2, QU Peiran2, YANG Zhijun2, WANG Bo2, LIU Pinan1,2★
(1. Beijing Neurosurgical Institute, Affiliated of Chinese Academy of Medical Science, Beijing 100050, China; 2. Department of Neurosurgery, Beijing Tiantan Hospital, Affiliated of Capital Medical University, Beijing 100050, China)

Objective To establish tissue bank of neurofibromatosis type 2 (NF2) and analysis its scientific value. Methods Medical records and long-term follow-up data of NF2 patients were collected for the establishment of data bank. Blood specimens of patients and high-risk family members of NF2 were taken, and the plasma, serum and lymphocytes were saved separately. Fresh tissues of NF2 tumors were obtained during the surgery and stored in liquid nitrogen, and some parts of tissue were formalin-fixed and parrffinembedded(FFPE). DNA of tumors and lymphocytes were extracted. Multipiex PCR and DNA seguencing were used for gene mutations analysis and screening test. Results 293 cases of NF2 patients, 72 specimens of frozen tissue, 275 specimens of FFPE tissue and 80 samples of blood were collected. OD260/280 ratios of DNA were between 1.80～1.86, and DNA fragments of 198 FFPE samples are between 1700～2500 bp. Both of them could be used for molecular genetic research. Conclusion Establishment of NF2 tissue bank could supply materials and datas for pre-symptomatic genetic screening, analysis of inheritance law and research of pathogenesis.

Neurofibromatosis type 2; Bank; Molecular genetics

國家科技支撐計劃課題（2012BAI12B03）；北京市自然科學基金（7112049）；北京市衛生系統高層次衛生技術人才隊伍建設專項經費資助

1.中國醫學科學院北京市神經外科研究所，北京100050；2.首都醫科大學附屬北京天壇醫院神經外科，北京 100050

★通訊作者：劉丕楠，E-mail:liupinan@gmail.com