一罕見成骨不全I(xiàn)V型的基因診斷

郭奕斌 艾陽 蔣瑋瑩

成 骨不 全（Osteogenesis imperfecta，OI），又 稱為脆骨病或Urolik 病、Lobstein 病、Van der Hoere病，是一類涉及骨發(fā)育不良、頻繁骨折的少見、罕見性遺傳性疾病，多數(shù)為常染色體顯性遺傳（AD），少數(shù)為常染色體隱性遺傳（AR）。發(fā)病率國外報(bào)道為1/10000～1/30000，而中國人群約為 4/10000[1]。臨床表現(xiàn)主要包括不同程度的骨折、骨畸形、骨脆性增加、藍(lán)鞏膜、牙本質(zhì)發(fā)育不全、聽力下降等。本病分為I～ Ⅷ八型[1～2]。其中，I型癥狀輕，無畸形；II型癥狀非常嚴(yán)重，圍產(chǎn)期即死亡；III型中度至重度畸形；IV型中等畸形。這四型都是由COL1A1、COL1A2基因控制，都為AD遺傳。Ⅴ型中等畸形，雖也是AD遺傳，但致病基因至今未明。Ⅵ型中等至嚴(yán)重畸形，為AR遺傳，致病基因也未明了。Ⅶ型中等畸形，AR遺傳，致病基因?yàn)镃RTAP；Ⅷ型嚴(yán)重畸形，圍產(chǎn)期即死亡，AR 遺傳，致病基因?yàn)?LEPRE1[1～2]。

臨床相對(duì)常見的是成骨不全I(xiàn)型和II型，而IV型和其它類型罕見。I型、II型、IV型都是由I型膠原基因（COL1A1、COL1A2）突變所致，只是突變的部位和突變的性質(zhì)不同而已。這兩個(gè)基因分別位于17q21～22和7q22.1上。其中，COL1A1基因長18 kb，有51個(gè)外顯子（exon）；COL1A2基因長38 kb，有52個(gè)外顯子[1]。

成骨不全至今仍無切實(shí)有效的根治手段。因此，檢出突變，明確診斷，闡明病因，對(duì)再次妊娠的高危胎兒實(shí)施產(chǎn)前基因診斷是目前防治該病的最佳應(yīng)對(duì)策略和優(yōu)生手段，也是開展孕早期診斷和胚胎植入前診斷的必要前提條件。下面對(duì)近期接診的一疑似成骨不全I(xiàn)V型或其他類型患兒的基因診斷結(jié)果報(bào)道如下。

1 對(duì)象和方法

1.1 研究對(duì)象

先證者：男，漢族，廣東籍，就診時(shí)1歲10個(gè)月，雙側(cè)藍(lán)鞏膜明顯，就診前已骨折兩次。據(jù)述，患兒出生2個(gè)月時(shí)即發(fā)現(xiàn)右腿骨折，不能抬頭。7個(gè)月時(shí)曾做過腰椎骶尾椎正側(cè)位X線檢查，結(jié)果顯示：腰椎、骶尾椎生理彎曲度存在，椎體順列正常，所見椎間孔、椎間隙未見變窄，余附件未見異常。1歲4個(gè)月時(shí)曾做過右足部正斜位X線檢查，結(jié)果顯示：右足各跖趾骨結(jié)構(gòu)完整，未見異常骨質(zhì)改變，各個(gè)關(guān)節(jié)間隙正常。X光片診斷：腰椎、骶椎未見明顯椎裂征象；右足未見異常X線征。1歲9個(gè)月時(shí)再次發(fā)生骨折，為右上肘發(fā)生關(guān)節(jié)脫位伴鷹嘴骨折。根據(jù)上述檢查資料，擬診為成骨不全，詳細(xì)病因及分型待查。

1.2 方法

1.2.1 外周血DNA模板的制備

抽取外周血2管，每管3～4 mL，EDTA抗凝，按我室已建立的方法快速制備模板DNA[3]。

1.2.2 PCR擴(kuò)增和電泳檢測

COL1A1基因的引物參照文獻(xiàn)[4]設(shè)計(jì)，由上海英濰捷基公司（Invitrogen company）和北京華大基因公司（BGI）分批合成。COL1A1基因各對(duì)引物的擴(kuò)增條件和產(chǎn)物大小參照文獻(xiàn)[1]。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2%～1.5%瓊脂糖凝膠電泳，溴乙錠（0.5 mg/mL）或EB替代品GoldView（0.1 μL/mL）染色，紫外燈下觀察擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.2.3 直接測序

將PCR產(chǎn)物交上海英駿公司或北京華大公司用ABI PRISM 3730型測序儀完成雙向測序。

2 結(jié)果

2.1 PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果

圖 1 為 COL1A1 基因 E（12～15）、E（2～5）、E1和E（46～47）擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果，各產(chǎn)物的分子量分別為 784 bp、1000 bp、349 bp 和 626 bp。M 為D2000 Marker。

2.2 測序結(jié)果

經(jīng)DNA序列分析，發(fā)現(xiàn)在COL1A1基因第12外顯子內(nèi)存在一典型的雜合錯(cuò)義突變c.823G＞C（GGT＞CGT），p.G275R。此外，還發(fā)現(xiàn)IVS16 ds（+129）T＞G，IVS24 as（-31）T＞C，IVS28 as（-14）T＞C，IVS36 as（-18）C＞G，IVS44 ds（+31）T＞C 等多個(gè)變異位點(diǎn)。 經(jīng)查HGMD數(shù)據(jù)庫和相關(guān)文獻(xiàn)，確認(rèn)其中的c.823G＞C/p.G275R突變?yōu)檎嬲鸪晒遣蝗獻(xiàn)V型的致病性突變[5]。應(yīng)用Chromas軟件比對(duì)正常對(duì)照者和患兒的COL1A1基因Exon 12的正向測序結(jié)果如圖2所示。

3 討論

成骨不全I(xiàn)V型（OI-IV）是一種以骨脆弱、藍(lán)鞏膜、中度骨骼畸形為典型特征的、罕見的遺傳性骨病，具有廣泛的表型異質(zhì)性[6]。患兒通常走路晚，一般多在骨折后才就醫(yī)，嚴(yán)重的在嬰兒期即可發(fā)生骨折如本例，輕的到三十多歲都沒有骨折發(fā)生[7]。IV型的致病基因和 I、II、III型相同，都是 COL1A1、COL1A2 基因，遺傳方式也都是AD遺傳。由于它的臨床癥狀和其他類型OI以及其他骨病有諸多相似之處，X線和B超檢查結(jié)果也頗為接近，故臨床診斷、影像學(xué)檢查和系譜分析只能初診。另外，由于它們都是基因病（為單基因病）、分子病（即不是酶蛋白病），所以常規(guī)的染色體核型分析和生化酶學(xué)檢查也無法診斷。確診只能靠相關(guān)基因的分子遺傳學(xué)檢測。但由于這兩個(gè)基因結(jié)構(gòu)復(fù)雜，外顯子加在一起多達(dá)103個(gè)，又沒有突變熱點(diǎn)[7]，因此基因診斷頗為費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、費(fèi)錢。目前，主要是根據(jù)PCR條件相同的exons進(jìn)行分組擴(kuò)增、測序。為了盡可能減少開支，縮短檢查時(shí)間，進(jìn)行基因診斷前有必要對(duì)各型進(jìn)行大致的鑒別診斷。比如先天性O(shè)I與遲發(fā)性O(shè)I之間，遲發(fā)性O(shè)I與軟骨發(fā)育不全（ACH）之間，先天性O(shè)I與致死性侏儒癥（TD）之間都有諸多相似之處，如果盲目檢測或全部檢測，勢必造成經(jīng)費(fèi)的浪費(fèi)和時(shí)間的損失。關(guān)于這些骨病的快速鑒別診斷可參見我室近期即將發(fā)表的相關(guān)文獻(xiàn)。

Marini等[5]（2007）報(bào)道，多數(shù)的 OI都是由COL1A1 基因突變所引起，且甘氨酸替換是COL1A 1基因最常見的突變，如本文所報(bào)道的p.G275R（甘氨酸→精氨酸）突變正是如此。另外，“甘氨酸→精氨酸”突變所引起的癥狀要比“甘氨酸→絲氨酸”或“甘氨酸→半胱氨酸”來得嚴(yán)重[7]，本例患兒出生2個(gè)月即發(fā)生骨折也印證了這一點(diǎn)。

本文發(fā)現(xiàn)的p.G275R錯(cuò)義突變，雖然國外已有報(bào)道并已確診為OI-IV型，但國內(nèi)至今還未見報(bào)道，可能跟病例罕見、開展本病基因研究的機(jī)構(gòu)少有關(guān)。本例患兒的家族無類似患者，父母非近親婚配，表型也完全正常，推測可能是母親在孕期服了藥或接觸了某種致變因素導(dǎo)致COL1A1基因發(fā)生突變并傳遞給了胎兒造成的。

目前，對(duì)于非致死的OI來說，可以通過外科手術(shù)、康復(fù)療法及藥物對(duì)癥治療來緩解病情，或者通過骨髓移植來治療，但后者費(fèi)用高昂且有相當(dāng)風(fēng)險(xiǎn)。因此，目前最為有效也是最佳的應(yīng)對(duì)策略就是對(duì)先證患兒進(jìn)行基因診斷，檢出突變，查清病因，然后對(duì)有家族史的或者經(jīng)超聲檢查疑似懷有OI患胎的高危孕婦進(jìn)行產(chǎn)前基因診斷，一旦查出患胎，即終止妊娠，這樣才能從根源上防止該病的發(fā)生，也才能真正實(shí)現(xiàn)優(yōu)生。

[1] 艾陽, 唐佳, 方群, 等. 一例成骨不全I(xiàn)I型高危胎兒的產(chǎn)前基因診斷[J]. 中華臨床醫(yī)師雜志: 電子版, 2011, 5(22):6662-6666.

[2] Van Dijk F S, Pals G, Van Rijn R R, et al. Classification of osteogenesis imperfecta revisited[J]. Eur J Med Genet, 2010,53 (1): 1-5.

[3] 唐佳, 潘敬新, 蔣瑋瑩, 等. 一例抗維生素D佝僂病的基因診斷和新突變的致病性鑒定[J]. 中華臨床醫(yī)師雜志: 電子版,2012, 6(5): 1226-1230.

[4] 王卓, 徐棟梁, 胡俊勇, 等. 成骨不全一家系的COL1A1基因突變分析[J]. 中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志, 2006, 23(2): 192-194.

[5] Marini J C, Forlino A, Cabral W A, et al. Consortium for osteogeneslis imperfecta mutations in the helical domain of type I collagen: regions rich in lethal mutations align with collagen binding sites for integrins and proteoglycans[J].Hum Mutat, 2007, 28(3): 209-221.

[6] Glorieux F H. Osteogenesis imperfecta[J]. Best Pract Res Clin Rheumatol, 2008, 22(1): 85-100.

[7] Cui Y X, Xia X Y, Shi Y C, et al. A G560S mutation in alpha1(I) collagen causes familial osteogenesis imperfecta type IV[J]. Clin Chim Acta, 2009, 409(1-2): 145-146.