1456例女性HPV基因分型結果的回顧分析

張滿娥 黃文蓉 張洪彬

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1456例女性HPV基因分型結果的回顧分析

張滿娥 黃文蓉 張洪彬

目的了解龍巖地區婦女HPV感染的陽性率與各年齡段的關系及各亞型的分布情況，為該地區宮頸癌防治及流行病學研究提供依據。方法采用反向斑點雜交-基因芯片法檢測1456例女性宮頸脫落細胞，以進行23種HPV基因型檢測，計算HPV感染的陽性率和年齡段的關系及HPV亞型感染分布特點。結果1456例標本中陽性540例，陽性率為37.09%，檢測出21種HPV亞型，HPV44亞型和MM4亞型未被檢出。低危亞型組主要以43亞型為主，高危亞型組優勢型別依次為HPV16、58和52。HPV感染的高峰年齡為30～50歲，各年齡組的HPV陽性檢出率有顯著差異（P＜0.05）。結論HPV基因分型檢測對宮頸癌防治有較好的指導意義。

人乳頭瘤病毒；基因分型；宮頸癌

人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）是一種強嗜上皮性、嚴格宿主范圍與組織特異性的DNA病毒。HPV可以通過多種途經感染生殖道而導致尖銳濕疣及宮頸病變，甚至引起宮頸癌的發生。HPV感染是宮頸上皮內瘤樣變（CIN）和宮頸癌發生的必要條件，HPV檢測已成為篩檢宮頸癌的有效方式。HPV感染的型別分布隨地理區域而變化，明確HPV在特定地區的感染率及型別分布差異能為該地區宮頸癌防治及流行病學研究提供依據及對HPV疫苗的開發應用有著重要的指導意義。為此我們對龍巖地區1456例女性HPV基因分型結果進行回顧分析，現報告如下：

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 病例來源

2011年4月至2012年4月于本院婦科就診的女性患者1456例，年齡在17～84歲，對所研究病例以年齡段為分組依據，20歲以下為一組，60歲以上為一組，中間年齡每10年為一個年齡段，即為一組。所有患者均為初次進行HPV檢測，剔除二次復查數據。

1.1.2 標本采集

醫生以窺陰器暴露子宮頸，用棉拭子將宮頸口過多的分泌物擦去，取出宮頸刷深入受檢者宮頸口內2～3 cm,順時針旋轉3～5圈。取出宮頸刷放入裝有保存液的樣品管中，將多余的刷柄折斷，旋緊管蓋，注明編號和日期。如不能馬上檢測，應將樣本置于4℃存放，并在一周內完成檢測，應避免反復凍融。

1.1.3 儀器與試劑

HPV基因分型檢測試劑盒（PCR-反向點雜交法）（深圳亞能生物技術有限公司生產），配有試劑盒Ⅰ與試劑盒Ⅱ，試劑盒Ⅰ主要為PCR反應液，試劑盒Ⅱ為HPV各基因亞型芯片、POD母液、TMB、30% H2O2以及裂解液等；PCR儀為美國ABI公司提供的ABI7000實時熒光定量分析儀，分子雜交儀為FINEPCR Combi-H12及YN 2009基因芯片閱讀儀。

1.2 方法

1.2.1 HPV DNA的提取：充分洗脫宮頸刷，并在管壁上擠干。把1 mL洗脫液全部轉移到1.5 mL的EP管中，13000 rpm離心10 min，棄上清液，加入50 μL裂解液充分懸浮沉淀，沸水浴加熱10 min，13000 rpm離心10 min，保留上清液待用。

1.2.2 PCR擴增HPV DNA：取出PCR反應管，在管蓋上做好標記，低速離心數秒，分別加入已提取的待測樣本DNA 5 μL,低速離心數秒后，按下述反應條件進行PCR擴增：50℃ 15 min；95℃ 10 min，94℃ 30 s，42℃90 s，72℃ 30 s，共 40個循環；最后72℃延長5 min。

1.2.3 雜交、洗膜與顯色均嚴格按照說明書進行。每次試驗均設陰性、陽性對照作為質量控制。

2 結果

2.1 1456例標本中HPV DNA檢出情況見表1

2.2 540例HPV陽性標本中高危亞型組（HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66，68、73、83、MM4）、低危亞型組（HPV6、11、42、43、44）及混合感染組檢測結果見表2。

2.3 不同年齡組HPV感染率見表3。

2.4 1456例標本中高危亞型（HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、83、MM4）與低危亞型（HPV6、11、42、43、44）檢出的例數分布見表4。

表1 1456例標本中HPV DNA檢出情況Table 1 The infection data of HPV DNA from 1456 samples

表2 540例HPV陽性標本中高危亞型組與低危亞型組檢測結果Table 2 The results of high-risk HPV types and low-risk HPV types in 540 cases of HPV positive samples

表3 各年齡組的HPV陽性率情況Table 3 The positive rate of HPV in every phase of age

表4 HPV亞型檢出例數的分布情況Table 4 Distribution of the detected HPV subtypes

3 討論

3.1 HPV基因分型檢測的意義有：①明確受檢者所感染的HPV病毒類型（高危型，低危型或復合型），了解患者是持續感染或新的感染；②根據感染的HPV亞型預測受檢者的發病風險，以制定正確合理且有效的治療方案和決定隨訪時間；③與病理檢查結果相結合，發現低度病變中的宮頸癌患者；④用于治療后的效果監測；⑤積累本地區人群HPV感染具體亞型的分布以及與年齡的關系，為研制適合中國人群的HPV預防和治療性疫苗提供數據。

3.2 人乳頭瘤病毒感染已被公認為是引起宮頸癌及宮頸上皮內瘤變的主要原因，HPV檢測在宮頸癌篩查中的作用已無可非議[1]。目前已發現100余種HPV亞型，有35種與生殖道疾病有關，但大多數感染是一過性的，可被自身的免疫系統清除，僅有一小部分高危型（HR-HPV）持續感染可發展為宮頸上皮內瘤變（CIN）進而發展為浸潤癌。子宮頸的癌前病變（CIN）到癌是一個相對較長時間的過程，即宮頸感染HPV→CIN→原位癌→早期浸潤癌→浸潤癌，研究顯示要經歷10年左右時間[2]。HPV感染可能的致病機制：在機體免疫力低下時整合到機體的核染色體基因組上，導致p53基因失活，因而不能正常表達，進而引起細胞增殖調節失控[3]。因此，我們可以及早發現和控制感染潛伏期和中間環節，及時檢測以篩查高危患者，并給予感染者防治性指導，這樣便可大大降低宮頸癌的發生。

3.3 預防和治療HPV感染的理想方法是疫苗接種。研制HPV疫苗需要了解各地區HPV型別的感染狀況及流行趨勢等資料和該地區HPV的感染率、感染優勢型別。本研究對龍巖地區女性進行HPV基因分型，陽性檢出率為37.09%，低于遼寧地區的47.28%[4]，接近重慶永川地區的37.65%[5]，高于濟寧等其它地區的檢出率23～31%[6～10]，這表明HPV的感染存在明顯的地區差異，應針對本地區的HPV的感染分布狀況,制定相應的預防措施。

3.4 在中國大陸HPV感染主要以HPV16亞型為主，居第一位，18亞型居第二位，58和52亞型分別居第三和第四位[11]。調查顯示龍巖地區女性HPV感染型別分布情況為低危亞型組主要以43亞型為主，高危亞型組優勢型別依次為HPV16、58和52，這與其它地區型別分布存在差異[4～10]。這一地域分布特點提示龍巖地區伴有HPV16、58和52宮頸感染的婦女發展成宮頸癌的可能性增加，同時也提示龍巖地區用于宮頸癌有效預防的HPV疫苗需要針對HPV16、58和52等型別。對于HPV52、58的感染率是否在國內其它地區也遠遠超過HPV18，這還有待其它地區相應的研究證實。

3.5 本調查結果顯示各年齡段的陽性檢出率在統計學上是有顯著性差異的，這提示HPV的陽性檢出率與年齡有關。表3中可見＜20歲年齡組陽性檢出率較高，但樣本數較少，同時為陽性百分比最低組；＞60歲年齡組陽性檢出率最高，其次分別為20～30歲組和50～60歲組。 HPV感染的高峰年齡為30～50歲，而福州地區HPV感染的高峰年齡為＜20歲和40～50歲[8]，內蒙古自治區中西部地區HPV感染的高峰年齡為36～40歲[10]。本研究表明，30～50歲組占陽性標本中的陽性百分比高，因此應加強30～50歲婦女HPV的普查力度。

3.6 本調查顯示龍巖地區女性HPV感染的單一型別感染率為24.86%,多重感染率為12.23%，高于內蒙古地區的多重感染率6.2%[10]；HPV高危亞型組占陽性標本的57.04%，HPV低危亞型組占陽性標本的25.00%，混合感染組占陽性標本的17.96%，低于濟寧地區的復合型感染率25.3%。有報道指HPV的多重感染對宮頸病變的發展有促進作用[6]，這有待于進一步探討。

4 結語

本調查通過對患者進行HPV檢測，調查所獲得的本地區HPV感染的感染率、感染優勢型別以及高發年齡段等資料可為本地區宮頸癌防治提供可靠的數據，為干預宮頸癌發生、發展制定相關措施提供理論依據，降低宮頸癌的發病率，減少社會醫療開支。

[1]喬友林, 章文華, 李凌, 等. 子宮頸癌篩查方法的橫斷面比較研究[J]. 中國醫學科學院學報, 2002, 24(1): 50-55.

[2]Ho G Y, Bierman R, Beardsley L,et al. Natural history of cervicalvaginal papillomavirus infection in young womem[J]. N Engl J Med, 1998, 338(7): 423-428.

[3]Steller M A. Human paplliomavirus,its genes and cancer vaccines[J]. Cancer Cell, 2003, 3: 7-8.

[4]Sun Z R, Ji Y H, Zhou W Q, et al. Characteristics of HPV prevalence among women in Liaoning province,China[J]. Int J Gynaecol Obstet, 2010, 109(2): 105-109.

[5]張曉靜, 袁瑞, 代紅瑩. 重慶永川地區婦科門診人乳頭瘤病毒亞型分布的研究[J]. 重慶醫科大學學報, 2010, 35(9): 2-8.

[6]梁鳳榮, 湯玉美, 劉燕, 等. 宮頸病變患者HPV基因分型[J].分子診斷與治療雜志, 2010, 2(6): 390-393.

[7]孫麗君, 婁雪玲, 王東紅, 等. 貴州省部分地區婦女宮頸人乳頭瘤病毒感染現狀調查及分析[J]. 中國綜合臨床, 2009, 25(9): 923-927.

[8]汪欣, 趙素萍, 魏建威. 福州地區935例婦女HPV感染情況的分析[J].分子診斷與治療雜志, 2011, 3(1): 33-35.

[9]張麗娜, 周蓓蓓, 陳昕華, 等. 區域性人乳頭瘤病毒基因型別檢測臨床研究[J]. 中國婦幼保健, 2010, 25(16): 1147-1149.

[10]宿瑞俊, 杜瑞軍. 內蒙古自治區中西部地區婦女宮頸人乳頭瘤病毒感染現狀調查及分析[J]. 分子診斷與治療雜志, 2011, 3(3): 173-176.

[11]LO K W, Wong Y F, Chan M K, et al. Prevlence of human papillomavirus in cervical cancer:a multicenter study in China[J]. Int J Cancer, 2002, 100(3): 327-331.

Retrospective analysis of 1456 cases of female HPV genotyping results

ZHANG Mane , HUANG Wenrong , ZHANG Hongbin
(Molecular Biology Laboratory, The Second Hospital of Longyan , Fujian Longyan 364000 , China)

Objective To investigate the relationship between the positive rate of female HPV infection and all ages and the distrubution of each subtype in Longyan region, in order to provide the basis for the prevention and control of cervical cancer and epidemiological study. Methods To detect 23 kinds of HPV genotype , calculate the relation between the positive rate of female HPV infection and all ages,the distribution characteristics of each subtype by dot blot hybridization reverse-gene chip to detect 1456 cases of female cervical exfoliated cells. Results 540 in 1456 cases were positive,with 37.09% positive rate. Among 540 positive samples, 21 subtypes of 23 known subtypes were detected .The HPV44 and MM4 subtypes had not been detected in this study.Low-risk type was mainly HPV 43 subtype and high-risk superior types were HPV 16,58 and 52. The peak age of HPV infection ranged from 30 to 50 years old.There was significant difference between different aged groups in HPV positive detection rate(P＜ 0.05). Conclusion HPV genotyping detection is meaningful in cervical cancer prevention and control.

Human papilloma virus; Gene subtypes; Cervical cancer

福建省龍巖市第二醫院分子生物學實驗室，福建，龍巖 364000