C57-ras癌癥轉(zhuǎn)基因小鼠模型胚胎冷凍保種技術(shù)研究

左 琴，劉甦蘇，周舒雅，劉佐民，王金恒，范昌發(fā)

(中國食品藥品檢定研究院，國家嚙齒類實(shí)驗(yàn)動物種子中心，北京 100050)

隨著轉(zhuǎn)基因和基因敲除模型動物模型的大量建立和廣泛使用，其保存和繁育體系的建立愈顯重要。模型動物的保存有活體保存和低溫冷凍保存兩種途徑，后者具有經(jīng)濟(jì)、降低模型動物遺傳漂變風(fēng)險(xiǎn)、避免因自然災(zāi)害疾病原因引起的品種丟失等優(yōu)勢。與普通小鼠相比，轉(zhuǎn)基因模型動物的胚胎顯得更加?jì)少F與脆弱，胚胎數(shù)量和質(zhì)量往往都不及普通動物。因而建立模型動物的低溫保種技術(shù)的難度更大。為了讓耗費(fèi)大量經(jīng)費(fèi)和經(jīng)過多年研究的模型動物品種資源得到妥善保存、以便為后續(xù)科研提供充足的動物，有針對性的研究和建立模式動物的低溫保種技術(shù)是非常有必要的［1］。

本研究在已有胚胎冷凍和體外受精技術(shù)基礎(chǔ)上，對本室自主建立的 C57-ras癌癥轉(zhuǎn)基因小鼠模型(專利公開號:CN101532018A)的低溫保種技術(shù)進(jìn)行了研究。通過直接收集體內(nèi)發(fā)育的2-細(xì)胞胚胎或者通過體外受精方法獲得2-細(xì)胞胚胎，采用玻璃化冷凍法冷凍、復(fù)蘇、移植，后代經(jīng) PCR檢測，獲得了陽性的轉(zhuǎn)基因動物，建立了該轉(zhuǎn)基因動物品系低溫保種方法，而且在轉(zhuǎn)基因小鼠的保種中，利用體外受精的方式替代直接收集體內(nèi)發(fā)育的2-細(xì)胞胚胎，提高了保種的效率。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

C57-ras癌癥轉(zhuǎn)基因動物模型為本室自主建立(專利公開號:CN101532018A)，是通過將人原癌基因c-Ha-ras原核注射至C57BL/6J 1-細(xì)胞胚建立;其余小鼠包括SPF級C57BL/6J小鼠和KM小鼠均來自于本單位【SCXK(京)2009-0017】。所有小鼠飼養(yǎng)于清潔級環(huán)境，飼喂SPF小鼠顆粒飼料，飲用滅菌自來水。溫度控制在(22 ±3)℃，自動光控(L∶D=12 h∶12 h，光照起始時(shí)間為 7∶00)。

1.2 主要儀器及試劑

CO2培養(yǎng)箱(Thermo 8000DH，美國)、體視顯微鏡(NIKON SMZ624，日本);孕馬血清(PMSG)、人絨毛膜促性腺激素(hCG)(均購于寧波第二激素廠，中國)、M2培養(yǎng)液(Sigma M7176，美國)和 KSOM 培養(yǎng)液(Millipore MR-106-D，美國)、DAP213凍存液和HTF培養(yǎng)液(日本熊本大學(xué)動物資源研發(fā)中心和上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司贈送)。PCR檢測所用試劑(購于寶生物工程(TaKaRa)大連有限公司，中國)，引物由北京諾賽基因研究公司合成。

1.3 方法

1.3.1 胚胎采集［3］

取4周齡的C57BL/6J雌鼠，間隔48h分別注射PMSG和 hCG，各10 IU/只進(jìn)行超排;待 hCG注射后與性成熟C57-ras雄鼠交配，次日晨檢陰道栓，見栓小鼠于hCG注射40 h后頸椎脫臼處死，取其輸卵管，M2培養(yǎng)液沖胚，在體視顯微鏡下回收形態(tài)正常的2-細(xì)胞期胚胎，清洗3次，移入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)待用。

1.3.2 體外受精［4］

同上對4周齡C57BL/6J雌鼠超數(shù)排卵。在第二天取C57-ras雄鼠的精子進(jìn)行精子培養(yǎng)獲能時(shí)，將注射hCG后15 h的C57BL/6J雌鼠頸椎脫臼處死，從輸卵管壺腹部取出卵母細(xì)胞團(tuán)，放入已平衡12 h的HTF液中培養(yǎng)。

將2～3只10～15周齡的 C57-ras雄鼠頸椎脫臼處死，取其附睪上體尾部，用解剖針刺破后擠出精子團(tuán)塊，放入在 CO2培養(yǎng)箱中已經(jīng)平衡12 h的HTF培養(yǎng)液中，培養(yǎng)1 h。

在顯微鏡下檢查培養(yǎng)1h的精子懸浮液的精子活力和精子數(shù)量，然后用移液器取 10 μL(約含精子200個(gè)/μL)精子懸浮液，加入到已經(jīng)取出的卵母細(xì)胞團(tuán)中，放入 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，在實(shí)體顯微鏡下，挑選出發(fā)育正常的2-細(xì)胞期胚胎，放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待凍存或胚胎移植。

1.3.3 胚胎冷凍和復(fù)蘇［5-6］

采用簡易玻璃化冷凍-解凍法凍存胚胎和復(fù)蘇胚胎。將待凍存的2-細(xì)胞胚置于1 mol/L DMSO液滴中靜置數(shù)分鐘，用微量移液器吸取5 μL含有所有胚胎的 DMSO于冷凍管中，在0℃恒溫器中平衡5 min，加入 DAP213溶液，再在 0℃條件下平衡 5 min后置于液氮中保存。

將凍存管從液氮中取出，室溫下靜置約30 s，加入9 mL 37℃預(yù)熱的0.25 mol/L蔗糖溶液，用移液器吹打10次，將溶液移入35 mm培養(yǎng)皿，室溫下靜置10 min，觀察記錄結(jié)果;將狀態(tài)良好的2-細(xì)胞胚移入KSOM培養(yǎng)液，放于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待移植。

1.3.4 胚胎移植［7］

2-細(xì)胞胚采用輸卵管移植法。結(jié)扎的KM雄鼠與正常KM雌鼠1∶1合籠，翌日檢查陰道栓，見栓記為假孕第1天。將復(fù)蘇胚胎移植至假孕1天母鼠的輸卵管內(nèi)，兩側(cè)各移植6～10個(gè)胚胎，出生后統(tǒng)計(jì)其產(chǎn)仔率。

1.3.5 PCR檢測

取離乳小鼠尾尖，按常規(guī)酚-氯仿法提取基因組DNA，PCR 反應(yīng)條件是:94℃ 4 min，94℃ 45 s，68℃45 s，72℃ 2 min，72℃ 5 min，30 個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增目的片段大小為408 bp。1%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。

1.4 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用SPSS7.1統(tǒng)計(jì)軟件，采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行結(jié)果分析。

2 結(jié)果

2.1 2-細(xì)胞期胚胎冷凍及復(fù)蘇結(jié)果

C57-ras轉(zhuǎn)基因雄鼠和普通 C57BL/6J雌鼠交配，獲得102枚2-細(xì)胞期胚胎。選擇其中90枚形態(tài)好的胚胎冷凍。共進(jìn)行3次復(fù)蘇實(shí)驗(yàn)，每次復(fù)蘇30枚凍存胚胎，平均復(fù)蘇成活胚胎20.33個(gè)，平均復(fù)蘇成活率是67.78%，3次復(fù)蘇組間第二組與其他兩組相比有極顯著差異(P＜0.01)。復(fù)蘇后分別移植到3只假孕鼠輸卵管中，總計(jì)獲得幼仔13只，得到3只陽性小鼠，見表1［8］。可見，轉(zhuǎn)基因動物胚胎冷凍較普通動物難度大，較難以把控，尤其對于純合致死的模型動物，保存胚胎有陽性小鼠的胚胎，也有野生型小鼠的胚胎，這意味著針對模式動物的胚胎冷凍技術(shù)，還需要進(jìn)行大量的摸索。

2.2 體外受精結(jié)果

取C57-ras轉(zhuǎn)基因雄鼠精子與普通C57BL/6J雌鼠卵母細(xì)胞團(tuán)在體外受精后，共收集到341個(gè)卵母細(xì)胞，其中有243個(gè)受精，有203枚胚胎發(fā)育到2-細(xì)胞期，平均體外受精率是58.49%，體外受精的3個(gè)分組間其中第一組的體外受精率是80.99%，與其他兩組相比有極顯著差異(P＜0.01)，這可能是第一組取的精液活率較高的原因，見表2。

2.3 體外受精2細(xì)胞胚胎冷凍復(fù)蘇結(jié)果

冷凍保存了203個(gè)體外受精的2細(xì)胞期胚胎，解凍復(fù)蘇了60個(gè)胚胎，平均復(fù)蘇率是63.33%，移植到2只假孕鼠輸卵管中，共產(chǎn)仔6只，見表3［8］。

2.4 通過PCR檢測產(chǎn)生移植產(chǎn)生小鼠

取移植產(chǎn)生的21只小鼠尾尖，提取基因組DNA后進(jìn)行PCR檢測，以確定是否獲得含有轉(zhuǎn)基因的陽性小鼠。通過兩次重復(fù)檢測，發(fā)現(xiàn)有5只幼仔小鼠為轉(zhuǎn)基因陽性(圖1)。

表1 2-細(xì)胞胚冷凍復(fù)蘇結(jié)果Tab.1 Result of recovery of C57-ras transgenic mice froze 2-cell embryo

表2 體外受精結(jié)果Tab.2 Result of C57-ras transgenic mice IVF

表3 體外受精2細(xì)胞期胚胎冷凍復(fù)蘇結(jié)果Tab.3 Result of recovery of C57-ras transgenic mice IVF froze 2-cell embryo

圖1 PCR檢測c-Ha-ras轉(zhuǎn)基因小鼠中目的基因的插入Fig.1 Identification of human c-Ha-ras gene integration with PCR

3 討論

3.1 DAP213玻璃化冷凍方法

本研究以自主建立的C57-ras癌癥轉(zhuǎn)基因動物模型為材料，開展了模式動物的胚胎冷凍和體外受精技術(shù)探索，以期建立模型動物的低溫保存方法。通過直接收集2-細(xì)胞胚和經(jīng)體外受精獲得2-細(xì)胞胚，并經(jīng)過玻璃化冷凍方法凍存、復(fù)蘇、移植、檢測，最終兩種途徑均獲得陽性轉(zhuǎn)基因動物。胚胎冷凍技術(shù)方法主要有緩慢冷凍法和玻璃化冷凍法，兩種方法各有其優(yōu)點(diǎn)。玻璃化冷凍法因其對設(shè)備要求低，操作簡單，而被廣泛采用。Nakagata建立以DAP213為抗凍保護(hù)劑的玻璃化冷凍法已經(jīng)程序化，并出現(xiàn)了商業(yè)化的胚胎冷凍試劑盒，便于建立一種快速、經(jīng)濟(jì)、可靠的胚胎冷凍技術(shù)方法［9］。本實(shí)驗(yàn)中采用了DAP213冷凍試劑盒冷凍2-細(xì)胞胚。通過3次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，解凍后平均復(fù)蘇率為67.78%，移植后的產(chǎn)仔率為21.31%，子代中的陽性率為23.08%。徐平等比較了12個(gè)品系的小鼠體外受精后2細(xì)胞期胚胎的凍存復(fù)蘇率在58.12%～83.19%間，表明不同遺傳背景的小鼠間凍胚復(fù)蘇率有差異［10］。

Nakagata的玻璃化冷凍法較易掌握，在凍存胚胎時(shí)使用的是凍存管，與其他使用塑料細(xì)管的玻璃化冷凍法相比較，避免了復(fù)雜的裝管程序，單次凍存的胚胎量多。但是有數(shù)據(jù)表明2細(xì)胞期的胚胎解凍復(fù)蘇后，培養(yǎng)到擴(kuò)張囊胚期的發(fā)育率，DAP213法是 39.1% ，EFS20/40 法是 93% ，后者更高［11］。

從原核期的胚胎到擴(kuò)展囊胚期的胚胎，各個(gè)時(shí)期的胚胎都可以冷凍保存，對于近交系和轉(zhuǎn)基因小鼠，在超數(shù)排卵后，獲得的晚期胚胎數(shù)量少于早期胚胎，我們建議近交系和轉(zhuǎn)基因小鼠選擇凍存早期胚胎。

3.2 體外受精和胚胎冷凍結(jié)合保存種子資源

在轉(zhuǎn)基因小鼠的擴(kuò)繁中，易出現(xiàn)繁殖能力低、食仔或不能自然交配等現(xiàn)象。采用體外受精技術(shù)，可以輔助不能自然交配或繁殖能力低的個(gè)體產(chǎn)生后代，在短時(shí)間內(nèi)快速獲得較多數(shù)量的動物。通過體外受精獲得小鼠胚胎并冷凍保存，這種方式可以較為安全的長期保存小鼠品系，通過移植也能較快的獲得轉(zhuǎn)基因活體動物，是目前保存小鼠遺傳資源的一種重要手段，同時(shí)也為轉(zhuǎn)基因小鼠模型推廣提供便利［12］。

常規(guī)冷凍保種的胚胎來源通常是需要數(shù)量較多的該品系雌鼠進(jìn)行超排，交配成功的雌鼠取胚胎冷凍，但是轉(zhuǎn)基因小鼠品系通常提供不了大量的雌鼠，而體外受精解決了這個(gè)問題，采用1-2只陽性轉(zhuǎn)基因雄鼠和其背景來源的雌鼠體外受精，就可以獲得大量的胚胎，進(jìn)行冷凍保存。

對來源于不同遺傳背景的35個(gè)小鼠品系超速排卵所得的卵母細(xì)胞與同品系小鼠精子進(jìn)行體外受精研究表明，不同遺傳背景的小鼠體外受精差異顯著(P＜0.05)，受精率在 15.2% ～97.2%之間［10］。本實(shí)驗(yàn)中采用 HTF為體外受精液，對 C57-ras轉(zhuǎn)基因小鼠體外受精中，受精率是59.53%，在對體外受精的2細(xì)胞期胚胎冷凍保存復(fù)蘇后，復(fù)蘇率是 63.33%，產(chǎn)仔率是 15.78%，后代陽性率是33.33%，和從體內(nèi)發(fā)育的2細(xì)胞期胚胎冷凍后的結(jié)果沒有差異，說明體外受精的胚胎可以作為一種胚胎來源方式進(jìn)行冷凍保存。

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