二次蒸餾-萃取耦合法提取頸復康制劑揮發油的研究

王春民， 楊冬麗*， 鄭艷春， 張瑞華

(頸復康藥業集團有限公司，河北省中藥新輔料工程技術研究中心，河北承德067000)

頸復康制劑揮發油的提取方法是將含有揮發油的藥材川芎、蒼術、羌活、乳香、沒藥按處方比例混合后用水蒸氣蒸餾法提取揮發油。其中川芎揮發油中所含川芎內酯類化合物對微血管具有解痙、增加毛細血管開放數目、加快血流速度的作用［1-2］。Z-藁本內酯和洋川芎內酯A是川芎內酯類化合物中質量分數較高的2種成分［3］，對發揮頸復康制劑活血通絡的功效起到了重要作用。研究表明川芎與其它藥材混合不利于Z-藁本內酯的提取，且隨著混合藥材種類的增加，藁本內酯提取率下降［4］。為此，開展對頸復康制劑揮發油的提取工藝研究，提高川芎內酯類的轉移率，較大限度的保留有效成分，提高藥品療效。本研究分別以Z-藁本內酯、洋川芎內酯A、蒼術素為指標考察二次蒸餾-萃取耦合法和傳統水蒸氣蒸餾法兩種提取方法對頸復康制劑揮發油提取效率的影響。

1 儀器與試藥

Agilent7890A氣相色譜儀，Agilent G4513A自動進樣器，HP-530 m×0.32 mm石英毛細管柱 (Agilent公司)，蒼術素對照品 (中國食品藥品檢定研究院，111924-201102)，Z-藁本內酯、洋川芎內酯A對照品 (上海順勃生物工程有限公司，純度≥98%)，無水乙醇 (天津市科密歐化學試劑有限公司，分析純)。川芎 (chuanxiong rhizoma，批號 100102)、蒼術 (atractylodis rhizoma，批號100401)、羌 活 (NotopterygiiRhizoma etradix，批 號100504)、乳香 (Bosewlliacarte，批 號 100301)、沒 藥(commiphora(Nees)Engl，批號100101)均由頸復康藥業集團有限公司提供，經王春民主任中藥師鑒定。

2 方法與結果

2.1 分析方法

2.1.1 揮發油中Z-藁本內酯、洋川芎內酯A、蒼術素的測定方法在文獻［5］研究基礎上，將測定方法確定為:采用HP-530 m×0.32 mm石英毛細管柱，FID檢測器，檢測器溫度250℃，脈沖不分流，程序升溫，初始溫度110℃，以1.5℃/min升溫至155℃，再以20℃/min升溫至250℃，保持3 min。載氣氮氣，進樣量2 μL。

2.1.2 標準曲線的繪制 精密稱取Z-藁本內酯、洋川芎內酯A、蒼術素對照品適量，用無水乙醇配成質量濃度分別為0.2、0.2、0.4 mg/mL的溶液，分別精密吸取Z-藁本內酯對照品溶液0.5、1、2、3、4、5 mL;洋川芎內酯A對照品溶液0.1、0.2、0.3、0.5、0.8、1.0 mL;蒼術素對照品溶液0.1，0.2，0.3，0.5，0.8，1 mL置10 mL量瓶中，用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，按上述色譜條件進樣檢測。分別以Z-藁本內酯、洋川芎內酯A、蒼術素的峰面積為縱坐標，對照品質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程分別為 Z-藁本內酯 Y=1047.3 X－6.326，r=0.9996;洋川芎內酯 A Y=1058.7 X－1.4251，r=0.9999;蒼術素Y=1011.3X－1.8131，r=0.9997線性范圍分別為 11.24 ～112.4 μg/mL;1.638 ～16.38 μg/mL;4.172 ～41.72 μg/mL。

2.1.3 供試品溶液的制備 精密吸取頸復康制劑揮發油1 mL，置10 mL量瓶中，用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，再精密吸取0.1 mL，置10 mL量瓶中，用無水乙醇稀釋至刻度，即得。

2.1.4 對照品溶液的制備 取Z-藁本內酯、洋川芎內酯A、蒼術素對照品適量，精密稱定，用無水乙醇分別配成質量濃度為25、5、16 μg/mL的溶液。見圖1。

圖1 對照品A和樣品B揮發油GC圖譜

2.1.5 儀器精密度 取同一供試品溶液，重復進樣6次，測定峰面積，計算 RSD分別為1.03%、1.11%、0.86%(n=6)，精密度符合要求。

2.1.6 重復性試驗 取同一批次提得的揮發油，按供試品溶液的制備方法，重復處理6份，測定，計算含量，RSD分別為1.22%、1.41%、1.37%(n=6)，重復性良好。

2.1.7 穩定性試驗 取同一份供試品溶液，分別于0，2，4，6，8 h測定峰面積，計算峰面積的RSD分別為1.08%、1.19%、0.97%。試驗結果表明供試品溶液在8 h內穩定。

2.1.8 加樣回收率試驗 精密吸取已知含量的揮發油0.5 mL，置10 mL量瓶中，用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，再精密吸取0.1 mL，至10 mL量瓶中，精密加入適量Z-藁本內酯、洋川芎內酯A、蒼術素對照品溶液，按供試品溶液的制備方法制備，在上述色譜條件下，進樣測定，計算平均回收率分別為99.6%、101.4%、100.5%，RSD分別為1.46%、1.37%、1.82%，(n=6)。

2.2 頸復康制劑揮發油的提取工藝研究

2.2.1 傳統水蒸氣蒸餾法 按處方比例取蒼術、川芎、羌活、乳香、沒藥，加6倍量水，用水蒸氣蒸餾法提取揮發油，提取6 h，GC法檢測揮發油中Z-藁本內酯、洋川芎內酯A、蒼術素的含量，計算轉移率。結果見表2。

2.2.2 二次蒸餾-萃取耦合法提取頸復康制劑揮發油 按處方比例取除川芎外的其余四味藥材，加6倍量水，用水蒸氣蒸餾法提取揮發油，得揮發油Ⅰ，備用;另取川芎藥材加6倍量水，并于揮發油提取器中加入一定量揮發油Ⅰ，用水蒸氣蒸餾法提取川芎揮發油，得揮發油II，合并揮發油Ⅰ和揮發油Ⅱ，GC法檢測。

2.2.2.1 考察不同揮發油提取時間對Z-藁本內酯、洋川芎內酯A轉移率的影響 按處方比例取蒼術、羌活、乳香、沒藥四味藥材，加6倍量水，用水蒸氣蒸餾法提取四味藥材揮發油，備用;另取川芎藥材加6倍量水，于揮發油提取器中加入0.2 mL四味藥材揮發油后，用水蒸氣蒸餾法提取川芎揮發油，提取時間分別為4 h、6 h、8 h。分別合并提得的川芎揮發油和四味藥材揮發油后，混勻，GC法檢測，計算揮發油中Z-藁本內酯、洋川芎內酯A的轉移率，考察不同提取時間對Z-藁本內酯、洋川芎內酯A轉移率的影響。結果見表1。

表1 提取時間對Z-藁本內酯、洋川芎內酯A轉移率的影響

研究表明，提取時間在4～6 h時，隨著提取時間的延長，Z-藁本內酯、洋川芎內酯A轉移率呈逐漸增加的趨勢;當提取時間達到8 h后，Z-藁本內酯的轉移率不再有明顯增加，而洋川芎內酯A的轉移率稍低于提取6 h的結果。因此，將提取時間確定為提取6 h。

2.2.2.2 不同揮發油萃取量對Z-藁本內酯、洋川芎內酯A、蒼術素轉移率的影響 按處方比例取蒼術、羌活、乳香、沒藥四味藥材，加6倍量水，用水蒸氣蒸餾法提取揮發油，備用;另取川芎藥材加6倍量水，分別于揮發油提取器中加入0.1、0.2、0.3 mL已提得的四味藥材揮發油后，用水蒸氣蒸餾法提取川芎揮發油。合并提得的川芎揮發油和四味藥材揮發油后，混勻，GC法檢測，計算混合后揮發油中Z-藁本內酯、洋川芎內酯A、蒼術素的轉移率，考察四味藥材揮發油的加入量對Z-藁本內酯、洋川芎內酯A、蒼術素轉移率的影響。結果見表2。

2.2.2.3 二次蒸餾-萃取耦合法提取工藝的確定 由實驗結果可知，四味藥材揮發油的加入量對Z-藁本內酯、洋川芎內酯A、蒼術素轉移率的影響較小，因此，考慮到實驗的可操作性和準確性，將四味藥材揮發油的加入量確定為0.2 mL。確定提取工藝為:按處方比例取蒼術、羌活、乳香、沒藥四味藥材，加6倍量水，用水蒸氣蒸餾法提取揮發油6 h，備用。另取川芎藥材加6倍量水，于揮發油提取器中加入0.2 mL四味藥材揮發油后，用水蒸氣蒸餾法提取川芎揮發油6 h，合并提得的川芎揮發油和四味藥材揮發油，混勻。GC法檢測混合后揮發油中Z-藁本內酯、洋川芎內酯A、蒼術素的轉移率，結果見表2。

表2 不同提取方法中Z-藁本內酯、洋川芎內酯A、蒼術素轉移率

由表中數據可以看出，四味藥材揮發油的加入量對Z-藁本內酯、洋川芎內酯A、蒼術素轉移率的影響較小。

與傳統水蒸氣蒸餾法相比，二次蒸餾-萃取耦合法提得的頸復康制劑揮發油，Z-藁本內酯、洋川芎內酯A的轉移率與傳統水蒸氣蒸餾法相比提高了約3倍，而對蒼術素的轉移率沒有明顯影響。

為進一步確定上述揮發油提取工藝的合理性，分別用兩種方法提得的頸復康制劑揮發油展開對小鼠鎮痛與活血作用的藥理學研究，結果顯示經二次蒸餾-萃取耦合法提得的頸復康制劑揮發油與水蒸氣蒸餾法提得的揮發油相比鎮痛與活血作用增強，具體內容將另文發表。

3 討論

研究表明采用二次蒸餾-萃取耦合法提取的頸復康制劑揮發油中Z-藁本內酯、洋川芎內酯A的轉移率與傳統水蒸氣蒸餾法相比提高了約3倍，而對蒼術素的轉移率沒有明顯影響。進一步證明川芎與其它藥材混合不利于內酯類成分的提取。

不同揮發油加入量對Z-藁本內酯、洋川芎內酯A轉移率無顯著影響，考慮到用于萃取的揮發油加入量太少會產生黏壁現象，因此，在進行研究時，加入0.2 mL。

本研究曾采用水蒸氣蒸餾法單獨對川芎藥材進行揮發油提取，隨著提取時間的延長，在提取過程中容易出現揮發油上下分層的現象，下層揮發油會逐漸隨著冷凝水流回至提取容器中，導致提取率大大降低，采用二次蒸餾-萃取耦合法提取時避免了分層現象的出現。分析原因可能是由于相似相溶的原理，使川芎揮發油分子更易聚集于極性相似的揮發油分子中而遠離極性較強的水中。

采用二次蒸餾-萃取耦合法提取頸復康制劑中的揮發油避免了單獨提取川芎揮發油時容易分層的現象，提高了Z-藁本內酯、洋川芎內酯A的轉移率的同時保持了其它揮發油成分轉移率。采用頸復康制劑的其它四味藥材揮發油作為萃取溶劑，最大限度的保留了有效成分的同時，避免了其它溶劑與成分的引入，該方法用于頸復康制劑中揮發油的提取更為合理。中藥揮發油成分復雜，尤其是多種藥材揮發油混合提取時，不同成分存在相互影響，因此提取工藝的確定值得研究。

［1］張 延.川芎藥效成分對照品的制備和定量分析方法的研究［D］.天津大學，2007.

［2］石力夫，鄭曉梅，秦 溱，等.Z-藁本內酯分解前后川芎揮發油對兔球結膜微循環影響的比較［J］.中國藥理學與毒理學雜志，1995，9(2):157.

［3］孫廣平.川芎內酯類成分制備工藝與分析方法［D］.天津大學，2006.

［4］張立國，張 超，王春民，等.混合提取對頸復康制劑中川芎揮發油提取率的影響［J］.中成藥.2011，33(9)1620-1622.

［5］王春民，楊冬麗，鄭艷春，等.頸復康顆粒原藥材配伍所含揮發油中Z-藁本內酯和洋川芎內酯A的測定［J］.中草藥，2012，43(7):1344-1346.