紫朱軟膏中龍血竭測定方法的研究

于 鑫， 李西林*， 夏 晶， 柳國斌， 牛東霞

(1.上海中醫(yī)藥大學中藥學院，上海201203;2.上海市食品藥品檢驗所職工技術協(xié)會質量標準研究所，上海200233;3.上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院，上海201203)

糖尿病足是糖尿病致殘的嚴重并發(fā)癥之一［1］，是由于糖尿病外周血管病變和 (或)神經病變感染等因素導致足或下肢組織破壞的一種病變［2］。目前，糖尿病足部潰瘍致殘、致死危害之高，給患者及社會都已帶來了沉重的負擔［3］。紫朱軟膏是上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院治療糖尿病足的經驗方，由朱砂、紫草、龍血竭、黃芪、阿膠、冰片六味中藥組成，具有清熱解毒、祛腐生肌、補氣益血之功效。其中，龍血竭為該驗方中的要藥，為傳統(tǒng)活血藥材，有“活血之圣藥”的美稱［4］，可以祛腐生肌、活血化瘀、止血收斂［5］，并可與多種藥物組成復方制劑［6-7］，在本經驗方中對治療糖尿病足起著重要作用，因此，控制龍血竭的量，對于建立紫朱軟膏的質量標準和保證其臨床療效具有重要的意義。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1100 Series高效液相色譜儀 (美國安捷倫公司)，SARTORIUSAG CP 224S型電子天平 (北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)，B5500S-MT型超聲清洗儀 (美國Branson公司)，Molcell細胞型超純水機 (上海摩勒生物科技有限公司)，Centrifuge 5810R型離心機 (德國Eppendorf公司)，Inertsil ODS-3 C18色譜柱 (GL Sciences有限公司)。

1.2 試藥 龍血素B標準品 (中國藥品生物制品檢定所，批號:111558-200202)，三氯甲烷 (分析純，國藥集團化學試劑有限公司)，乙腈 (色譜純，Merck KGaA公司)，硅藻土 (化學純，上海凌峰化學試劑有限公司)，冰醋酸(分析純，上海凌峰化學試劑有限公司)，紫朱軟膏為實驗室自制，水為經Molcell細胞型超純水機處理的超純水。

2 方法與結果

2.1 試樣溶液的制備

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取龍血素B對照品10 mg，于10 mL量瓶中，加三氯甲烷定容至刻度，搖勻;取上述溶液2 mL至100 mL量瓶中，加三氯甲烷稀釋至刻度，搖勻;取上述稀釋后溶液10 mL至20 mL量瓶中，水浴揮干三氯甲烷，殘渣加乙腈溶解至刻度，搖勻，即得對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液 取紫朱軟膏2.5 g，精密稱定，加硅藻土5 g，研磨混合均勻。加冰醋酸溶液 (1→90)-乙腈(1∶1)的混合溶液50 mL，稱質量，超聲處理30 min，放冷，加冰醋酸-乙腈的混合溶液補質量，搖勻，4 000 r/min離心20 min。將上清液過濾，取續(xù)濾液過0.45μm有機微孔濾膜過濾，即得。

2.2 色譜條件 采用Inertsil ODS-3 C18色譜柱 (4.6 mm×250 mm，5μm)，以冰醋酸 (1→90)-乙腈 (63∶37)為流動相;體積流量1.0 mL/min;檢測波長275 nm;柱溫30℃;進樣量10μL。各測試樣品的圖譜結果見圖1。

2.3 方法學考察

2.3.1 取樣量的考察 分別取紫朱軟膏與硅藻土的混合物5.0g、7.5g、10.0g，精密稱定，按供試品溶液處理方法進行處理，進樣測定并計算 (采用外標兩點法)。每個樣品重復3份，RSD分別為2.10%、1.66%、1.72%。

結果見表1。結果表明，取樣量對測定結果影響不大，按測定結果擇優(yōu)選擇，取樣量確定為7.5 g。

圖1 各測試樣品HPLC測定圖譜

表1 取樣量的考察結果 (n=3)

2.3.2 超聲時間的考察 取紫朱軟膏與硅藻土的混合物7.5 g，精密稱定，按供試品溶液處理方法進行處理，超聲處理時間分別為10、20、30、40 min。進樣測定并計算(采用外標兩點法)。每個樣品重復3份，RSD分別為1.58%、1.34%、1.42%、1.66%。結果見表2。結果表明，超聲處理30 min所測得的量最高，為最適宜的超聲時間。所以，超聲時間確定為30 min。

表2 超聲時間的考察結果 (n=3)

2.3.3 提取溶劑比例的考察 取紫朱軟膏與硅藻土的混合物7.5 g，精密稱定，按供試品溶液處理方法進行處理，分別加入提取溶劑冰醋酸溶液 (1→90)-乙腈 (1∶1)及冰醋酸溶液 (1→90)-乙腈 (1∶2)50 mL。進樣測定并計算(采用外標兩點法)。每個樣品重復3份，RSD分別為1.28%，1.44%。結果見表3。結果表明，提取溶劑冰醋酸溶液 (1→90)-乙腈比例為1∶1優(yōu)于比例為1∶2，故選用提取溶劑為冰醋酸溶液 (1→90)-乙腈 (1∶1)。

表3 提取溶劑比例的考察結果 (n=3)

2.3.4 提取溶劑用量的考察 取紫朱軟膏與硅藻土的混合物7.5 g，精密稱定，按供試品溶液處理方法進行處理，分別加入提取溶劑冰醋酸溶液 (1→90)-乙腈 (1∶1)50 mL及100 mL。進樣測定并計算 (采用外標兩點法)。每個樣品重復3份，RSD分別為1.97%、2.02%。結果見表4。結果表明，50 mL和100 mL提取溶劑對測定結果影響不大，故從節(jié)省溶劑的角度考慮，提取溶劑用量確定為50 mL。

表4 提取溶劑用量的考察結果 (n=3)

2.4 標準曲線 精密稱取龍血素B標準品，以乙腈為溶劑，制 成 質 量 濃 度 為 2.100、2.625、3.500、5.250、7.000、10.500、21.000、35.000、70.000、105.000 μg/mL的對照品溶液。在上述色譜條件下分別進樣10μL，記錄峰面積。以標準品質量濃度為橫坐標，所對應的峰面積為縱坐標 (運用外標兩點法)，繪制標準曲線。回歸方程為Y=29.926X－22.357，R2=0.999 5。在 2.100～105.000 μg/mL質量濃度范圍內線性關系良好。

2.5 精密度實驗 取對照品溶液 (10.5μg/mL)，連續(xù)進樣5次，每次10μL，按色譜條件測定，峰面積 RSD為0.62%。

2.6 穩(wěn)定性實驗 取紫朱軟膏供試品溶液，分別于0、1、2、4、10、16、24、48 h，按色譜條件測定，記錄所測組分峰面積，計算龍血素B含有量的RSD為2.46%，表明供試品溶液在0～48 h內穩(wěn)定性良好。

2.7 重復性實驗 取紫朱軟膏與硅藻土的混合物7.5 g，精密稱定，按供試品溶液處理方法進行處理，按色譜條件測定，進行6次平行實驗，結果龍血素B的平均質量分數(shù)為154.786 5μg/g，RSD為2.94%，表明本方法對樣品的測定重復性良好。

2.8 加樣回收實驗 取紫朱軟膏與硅藻土的混合物3.75 g，精密稱定，分別加入80%、100%、120%的龍血素B標準品溶液，每個一式三份，按供試品溶液處理方法進行處理，按色譜條件測定，計算回收率，結果見表5。結果表明，加樣回收率在90%～110%之間，說明方法可靠，結果準確。

表5 加樣回收率測定結果 (n=3)

2.9 重現(xiàn)性實驗 在不同時間內，選擇兩位實驗人員，對紫朱軟膏進行試驗，計算龍血素B量的相對平均偏差為1.40%，表明不同人員在不同時間內測得的龍血素B的結果基本一致，說明方法適用性較強，重現(xiàn)性符合要求。

2.10 樣品測定 取樣品依法測定，每個樣品重復測定3份，結果見表6。

表6 紫朱軟膏中龍血竭的測定結果 (n=3)

3 討論

龍血竭的質量控制手段主要有薄層色譜法、紫外可見分光光度法和高效液相色譜法等對已知化合物 (如龍血素A、龍血素B等)進行定量測定［8-10］。龍血素B是龍血竭的主要成分，是一種酚類化合物［11］。文獻報道中大多通過測定龍血素B的定量來對其進行質量控制［12］。紫外可見分光光度法測定龍血素B的方法專屬性較差，并且在復方制劑中容易受到干擾，因此用高效液相色譜法測定龍血素B具有更好的專屬性。本研究建立的高效液相色譜法考察了甲醇-冰醋酸水溶液、乙腈-冰醋酸水溶液流動相系統(tǒng)，以及不同冰醋酸的量對分離效果的影響，最后參考相關文獻［13-15］，采用冰醋酸 (1→90)-乙腈 (63:37)系統(tǒng)為流動相，檢測波長為275nm，能得到較好的分離度，峰形良好，出峰時間適宜，方法學考察符合要求，可用于紫朱軟膏中龍血竭的質量控制。

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