正交試驗優選制首烏水煎煮工藝

張振娟 劉代華 梁建成 張三平

廣西科技大學附屬醫院 柳州市人民醫院藥劑科，廣西 柳州 545006

制首烏為蓼科植物何首烏的干燥塊根經炮制后所得，傳統中醫理論認為何首烏甘補兼澀，不寒不膩不燥，善補肝腎，益精血，為滋補良藥。現代藥理研究表明，何首烏具有調節血脂、延緩動脈粥樣硬化、抗衰老、提高免疫力、益智等作用[1-2]。最新藥理研究還發現何首烏的代表性成分二苯乙烯苷具有抗抑郁作用[3]，二苯乙烯苷含藥血清對骨髓間充質干細胞增殖有明顯促進作用[4]，臨床上常用于高脂血癥，在養生保健等領域也有廣泛應用。通過查詢文獻發現，何首烏中有效成分二苯乙烯苷的提取工藝有大孔吸附樹脂法[5]、超聲提取法[6]、超臨界 CO2萃取法[7]、乙醇回流提取法[8]，未發現臨床上普遍使用的水提取（即水煎煮）方法的研究，而在水提取過程中影響有效成分溶出的因素有煎煮器具、火力、飲片大小、加水量、浸泡、煎煮時間、煎煮次數，這些因素中可控的是煎煮器具和火力，結合文獻資料[9-11]及生活中實際操作的情況，本試驗選擇飲片大小、浸泡時間、煎煮時間、煎煮次數為考察因素，以制首烏的代表成分二苯乙烯苷為評價指標，采用L9（34）正交試驗設計、高效液相色譜法優選何首烏的最佳水煎煮工藝條件，為獲得高質量的何首烏水煎劑提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-10A高效液相色譜儀 （日本島津），SPD-10AVP紫外檢測器（日本島津），威瑪多媒體色譜數據工作站，色譜柱Hypersil CN（10 μm，4.6 mm×150 mm），電子天平（BP211D型，北京賽多利斯儀器系統有限公司）；A2366超聲波清洗器（中船重工七院七二六所），XW-80A型離心機（上海醫大儀器有限公司），針筒式微孔濾膜過濾器（水型，規格：13 mm，孔徑：0.45 μm，天津市騰達過濾器件廠）。JZY-10型電動煎煮機、不銹鋼煎煮鍋（天津三延精密器械有限公司）。

1.2 藥材和試劑

制何首烏飲片（批號：20121022）購自廣西柳州百草堂藥業有限公司中藥飲片廠，經廣西科技大學附屬醫院藥劑科藥檢室鑒定為蓼科植物何首烏的干燥塊根炮制品。分揀為大塊：粒徑25 mm左右，小塊：粒徑10 mm左右，粗粉：機械粉碎，過 10 目篩。對照品：2，3，5，4′-四羥基-二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷（二苯乙烯苷）（中國藥品生物制品檢定所提供，批號：110844-201109），稀乙醇（自配：取乙醇529 mL，加水稀釋至1000 mL，即得。本液在20℃時含C2H5OH應為 49.5%～50.5%mL/mL[6]）乙腈為色譜純，水為去離子水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 HPLC 法測定 2，3，5，4′-四羥基-二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷含量[12]

2.1.1 色譜條件 色譜柱色譜柱為Hypersil CN（10 μm，4.6 mm×150 mm）；柱溫為室溫；檢測波長為320 nm；流速為0.8 mL/min；流動相為乙腈-水（18∶82）；進樣量為 20 μL；在上述色譜條件下，對照品和樣品的色譜圖見圖1。

圖1 對照品及制首烏HPLC色譜圖

2.1.2 對照品溶液制備 精密稱取二苯乙烯苷對照品11.86 mg，置于50 mL棕色容量瓶中，加稀乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成237.20 μg/mL的標準儲備液。

2.1.3 陰性對照溶液的制備 按降脂方取缺何首烏的空白樣品，按供試品溶液制備陰性對照溶液。

2.1.4 系統適應性試驗 取對照品溶液按《中國藥典》2010年版，連續進樣 5 次，RSD 為 0.46%，理論塔板數按 2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯苷-2-O-β-D-葡萄糖苷計算不低于2000。取供試品溶液測定，理論塔板數按 2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯苷-2-O-β-D-葡萄糖苷計算為2957，分離度為3.22，符合《中國藥典》2010年版要求。

2.1.5 空白試驗 吸取對照品溶液、供試品溶液、缺何首烏的陰性對照溶液，分別注入液相色譜儀，結果空白對照液在與對照品色譜相應位置上無吸收，說明空白對照液無干擾。2.1.6線性關系的考察 精密吸取上述對照品溶液10、6、4、2、1 mL，分別置于50 mL棕色容量瓶中，加稀乙醇至刻度，搖勻，分別制成濃度為 47.44、28.46、18.98、9.49、4.74 μg/mL的溶液。分別精密吸取20 μL進樣，按上述色譜條件測定峰面積。以進樣濃度（X）為橫坐標，以峰面積值（Y）為縱坐標，計算得回歸方程為 Y=1.85×10-5X＋0.375，r=0.999988，結果表明二苯乙烯苷進樣量在4.74～47.44 μg/mL范圍內，峰面積與進樣量之間呈良好線性關系。

2.1.7 精密度試驗 精密吸取61.44 μg/mL對照品20 μg/mL連續進樣5次，測定峰面積，RSD為0.402%，表明儀器的精密度良好。

2.1.8 穩定性試驗 取供試品溶液，間隔約2 h分別于0、1、3、6、8 h 進樣，測定峰面積，結果 RSD 為 0.1124%（n=5），表明樣品在8 h內穩定。

2.1.9 加樣回收率試驗 精密量取已知濃度的供試品溶液1mL，共 6 份，分別精密加入 1 mL 20.48、61.44、102.40 μg/mL 濃度供試品，各2份，測定，計算，加樣回收率分別為100.79%、100.61%、100.12%、99.41%、101.53%、102.09%。

2.1.10 供試品溶液的制備及測定 稱取制首烏藥材9份，150 g/份，統一8倍加水量，按正交表表1的設計進行煎煮（多次煎煮者第2次及第3次的煎煮時間和加水量為第1次的一半，合并煎液），趁熱過濾，濃縮定容至200 mL。取濾液15 mL離心后上清液再經濾紙、針筒式微孔濾膜過濾器過濾，取濾液2 mL置于10 mL棕色容量瓶中，加稀乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。在上述色譜條件下取20 μL進樣測定，計算。

2.2 正交試驗設計

采用L9（34）正交試驗設計，選擇藥材粒度、浸泡時間、煎煮時間、煎煮次數4個因素，每個因素3個水平，因素水平見表1，試驗設計結果見表2，方差分析見表3。

表1 因素水平表

表2 正交試驗設計及結果

2.3 正交試驗結果分析

由直觀分析結果可以看出，4個因素對二苯乙烯苷的溶出量影響程度不同，依次為D＞C＞A＞B，故以B為誤差項進行方差分析。在表3方差分析中可以知道，A、C、D三因素影響顯著，最優水平組合為A3B2C3D3。

2.4 驗證試驗

取制首烏150 g三付，按最佳水煎煮工藝分別進行煎煮，取煎液按“2.1.4”項下測定二苯乙烯苷含量，分別為41.32、44.11、39.88 μg/mL。驗證試驗結果與正交試驗結果基本吻合，說明工藝穩定可行。

表3 方差分析表

3 討論

在煎煮過程中，粗粉煎液極其渾濁，分離困難，不論是家庭煎煮，還是醫療機構代煎都難以解決，從粒度因素的試驗數據看，小塊和粗粉的二苯乙烯苷溶出量比較接近，故應選擇小塊粒度為最佳。

從理論上講，浸泡可以使干癟的組織細胞膨脹，細胞間隙變大，利于溶劑的穿透浸提，但試驗結果顯示是否浸泡對本實驗結果影響不顯著，這可能是由于制何首烏質地堅硬，難以浸透，且因煎煮時間較長，因此相對于其他顯著因素來說影響并不大。

二苯乙烯苷為水溶性成分，較長時間的煎煮利于其溶解滲出，從試驗結果來看二苯乙烯苷的溶出率與煎煮時間呈正相關，與理論相符。

中藥煎煮過程中，藥材內外溶質與溶劑的濃度差是有效成分溶出的推動力，更換新溶劑即多次煎煮是保持最大濃度差最便利的手段，但多次長時間煎煮也會造成高分子雜質增多，有效成分被破壞，且會造成時間和能源的浪費，故在二煎和三煎時選定時間為頭煎的一半。

綜上所述，最佳工藝條件為A2B2C3D3，即粒度為小塊，浸泡30 min，煎煮時間70 min，煎煮3次，第2次及第3次的煎煮時間和加水量為第1次的一半，合并煎液即可。本試驗通過正交試驗優選出最佳提取工藝穩定、可靠，為何首烏的水提取工藝提供了試驗數據，可為獲得高質量的何首烏水煎劑提供參考。

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