阿托伐他汀對阿爾茨海默病模型小鼠學習、記憶功能及Klotho 蛋白的影響

楊松 吳德紅 柯燕 蔡克濤 武謙

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)發病可能與一種名為Klotho 的衰老相關基因有關［1］。該基因主要在腦內海馬組織表達，基因敲除的Klotho 小鼠過早出現和人類衰老、老化相關的多種行為和病理生理改變［2］。進一步研究發現在小鼠海馬組織內，Klotho蛋白可能通過與細胞膜表面的特定受體結合而啟動細胞內的信號傳導，該信號傳遞可以抑制胰島素胞內信號傳導從而出現胰島素抵抗［3］。

近年來，阿托伐他汀對癡呆的防治作用正逐漸引起人們的關注［4］。國外研究證實，他汀類藥物不僅能預防癡呆，對罹患癡呆的病人，還可能延緩和改善癡呆的進展和癥狀［5-6］。

本文通過觀察阿托伐他汀對癡呆模型小鼠學習、記憶功能及Klotho 蛋白的影響，初步探討阿托伐他汀改善癡呆的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 清潔級雄性昆明種健康小鼠40 只，體質量27 ～35 g，6 周齡，由湖北醫藥學院實驗動物中心提供，動物合格證號110425，隨機分為模型組、生理鹽水組、阿托伐他汀組和加蘭他敏組，每組10 只。

1.2 藥物、試劑及儀器 阿托伐他汀(北京嘉林藥業，110211429);加蘭他敏(西安楊森制藥有限公司，940929);Aβ1-40購自于美國sigma 公司;將Aβ1-40溶解在高壓滅菌生理鹽水內，貯存液濃度10 g/L，過濾除菌，－20 ℃保存。臨用前37 ℃孵育4 d，使其變為聚集狀的Aβ。Klotho 及胰島素的ELISA 試劑盒購自上海藍基生物有限公司，嚴格按照試劑說明書操作;其他相關儀器均由十堰市太和醫院生命研究所提供。

1.3 模型制備 動物以10%水合氯醛250 mg/kg 腹腔注射麻醉后，以立體定位儀固定頭部，剪開頭皮，暴露頭骨，在前囟后、中線右側旁，用牙科鉆鉆開顱骨，微量注射器自腦表面垂直進針，模型組、阿托伐他汀組和加蘭他敏組動物于右側腦室內緩慢注射10 mg/ml 的Aβ1-402 μl，生理鹽水組動物相同部位注射同等容積生理鹽水，留針5 min 后慢慢退出。以慶大霉素9 mg/kg局部消毒，縫合皮膚。

1.4 動物處理 阿托伐他汀組動物給予阿托伐他汀5 mg/kg 灌胃，加蘭他敏組動物給予加蘭他敏1.03 mg/kg 灌胃，生理鹽水組和模型組給予等量生理鹽水灌胃，每天1 次，進行28 d。

1.5 Morris 水迷宮實驗 根據Morris 實驗方法進行操作［7］，實驗分為兩部分:(1)定位航行實驗:用于測量小鼠對水迷宮學習和記憶的獲取能力。第1 天讓小鼠自由游泳2 min;從第2 天起，每天分上、下午兩段，每段訓練4 次。訓練時隨機選擇一個入水點，將小鼠面向池壁放入水中，記錄小鼠尋找并爬上平臺時所需時間(潛伏期)，每次訓練間隔為60 s。如果大鼠在120 s 內未找到平臺，須將其引至平臺，這時潛伏期記為120 s。(2)空間搜索實驗:在第5 天最后一次訓練后撤除水下平臺，在同一入水點將大鼠面向池壁放入水中，測其在120 s 內跨過原平臺相應位置的次數。

1.6 Klotho 蛋白及胰島素的檢測 將各組小鼠置于冰盤上開顱取腦，棄去嗅球和小腦，稱取海馬組織，用預冷的生理鹽水制成10 g/L 勻漿，4 ℃下3000 r/min離心15 min，取上清液－20 ℃保存。采用酶聯免疫分析法測定海馬組織Klotho 蛋白及胰島素含量。

1.7 統計學分析 數據采用SPSS 16.0 進行統計學分析，組間比較采用t 檢驗，P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Morris 水迷宮實驗 與模型組小鼠相比，阿托伐他汀組、生理鹽水組和陽性對照組動物的逃避潛伏期明顯縮短，而跨越平臺次數明顯增加，差異存在統計學意義(P ＜0.05);阿托伐他汀組與生理鹽水組、加蘭他敏組相比，其逃避潛伏期及跨越平臺次數無明顯差異。見表1。

表1 各組小鼠Morris 水迷宮學習及記憶成績比較(±s，n=10)

表1 各組小鼠Morris 水迷宮學習及記憶成績比較(±s，n=10)

注:與模型組比較，* P ＜0.05

組別逃避潛伏期(s) 跨越平臺次數(n)45.78 ±3.201.64 ±0.91生理鹽水組19.86 ±2.35*7.86 ±1.34*阿托伐他汀組24.44 ±3.05*5.38 ±1.36*加蘭他敏組21.39 ±2.78*5.51 ±0.85模型組*

2.2 海馬組織Klotho 蛋白及胰島素水平 生理鹽水組和阿托伐他汀組動物Klotho 蛋白定量明顯高于模型組(P ＜0.05);與模型組比較，阿托伐他汀組胰島素水平明顯增加(P ＜0.05);模型組與生理鹽水組及加蘭他敏組的胰島素定量測定無明顯差異。見表2。

表2 阿托伐他汀對Klotho 蛋白及胰島素的影響(xˉ±s，pg/ml，n=10)

3 討論

加蘭他敏是從石蒜屬植物中分離出的可逆性乙酰膽堿酯酶抑制劑，用于治療輕度到中度阿爾茨海默型癡呆癥，可改善記憶障礙［8］。本研究以加蘭他敏處理作為陽性對照，以探討阿托伐他汀對AD 小鼠的影響。

他汀類藥物可能通過調節腦內膽固醇代謝、抑制載脂蛋白E 表達、減少β 淀粉樣蛋白形成、降低卒中風險和增強膽堿能神經元功能等機制起到防治癡呆的作用［9］。近年來研究顯示，他汀可通過上調Klotho 基因的表達而部分糾正衰老相關的癥狀及體征［10-11］。本文結果提示阿托伐他汀可改善癡呆小鼠的學習及記憶功能，其機制可能與對Klotho 基因表達的上調有關。

最新研究發現，Klotho 基因不但在腦脈絡膜大量表達，海馬內也有很強的表達［3］;該基因過度表達的小鼠體內血漿Klotho 蛋白濃度升高的同時，胰島素的水平也明顯升高，相反Klotho 基因缺陷的同時胰島素濃度也出現下降［1］。進一步的研究認為Klotho 蛋白通過與細胞膜表面尚未鑒定的特定受體結合而啟動了細胞內的信號傳導，該信號傳遞可以抑制胰島素和胰島素樣生長因子-1(IGF-1)的胞內信號傳導，因此出現胰島素抗性;對Klotho 基因突變小鼠同時進行胰島素/IGF-1 通路干涉處理后，這種小鼠的衰老癥狀明顯緩解［12-13］。我們的研究證實了Klotho 蛋白與胰島素的同向性改變，提示Klotho 蛋白通過這種胰島素信號傳導途徑引起的胰島素抗性可能是改善癡呆的重要方式。

其他相關的2 種機制可能為他汀上調Klotho 基因的表達，改善小鼠學習及記憶功能作另一注解。Narumiya 等［10］發現在培養的IMCD3 細胞中，阿托伐他汀通過抑制細胞通路RhoA 途徑上調Klotho 基因mRNA的表達，且這一表達有著非常顯著的劑量效應關系;這一結果也被國內的研究所證實［11］。此外，氟伐他汀也被認為有促進Klotho 基因敲除雜合子小鼠血管新生的作用，其作用機制可能是通過VEGF-p-Akt-NO 路徑實現的［14］。

綜上所述，阿托伐他汀可改善AD 小鼠的學習及記憶功能，其機制可能與其對Klotho 基因表達的上調有關。

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