臍帶間充質干細胞源性多巴胺能神經元中腦源性神經生長因子的表達研究

李慧 趙璨 張華 張曉光 歐陽溪 馮美江

帕金森病(Parkinson's disease，PD)是一種以黑質致密部多巴胺能神經元減少為主要病理特征的慢性進行性中樞神經系統退行性疾病。目前臨床上主要通過藥物或手術控制癥狀，但并不能阻斷PD的病理生理進程，所以仍需尋找針對PD病因的治療方法［1-2］。近年來研究證實，臍帶間充質干細胞(MSCs)能被誘導分化為多巴胺(DA)能神經元，移植入PD模型鼠后癥狀改善，且中腦酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)表達量增加，因此可以作為PD的理想治療方案。此外，越來越多的研究表明，分泌腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)可能是干細胞發揮作用的機制之一［3-4］。本研究嘗試將人臍帶間充質干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，HUCMSCs)誘導分化為多巴胺能神經元(dopam-inergic neurons)并對其鑒定，進一步觀察細胞中BDNF的表達情況。

1 材料和方法

1.1 材料 熒光二抗(購自武漢博士德公司)，堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、音猥因子 (SHH)、成纖維細胞生長因子8(FGF8)、腦源性神經營養因子(BDNF)(購自RD公司)，Tryple酶和N2因子(購自GIBCO公司)，維生素C(Vit-C)和抗-TH抗體(購自美國Sigma公司)，抗-BDNF抗體和抗-β-微管蛋白Ⅲ抗體(購自 abcam公司)，抗-神經元核抗原(NeuN)抗體(購自北京中杉金橋公司)，DAPI(購自碧云天公司)，倒置熒光顯微鏡(為Olympus公司產品)。

1.2 方法

1.2.1 臍帶MSCs的分離培養:本實驗遵照倫理學標準及國家有關規范。在無菌條件下收集足月產健康新生兒臍帶，用生理鹽水充分沖洗并剔除臍動、靜脈，剝離出華通氏膠后將其剪碎至1 mm3大小，接種于DMEM培養液(含10%胎牛血清)中，置37℃、5%CO2飽和濕度的孵育箱內培養。16 d時用Tryple酶消化，見胞質回縮時加入DMEM培養液(含10%胎牛血清)終止消化，將細胞懸液放入離心管內，800 r/min離心8 min，生理鹽水洗滌2次，原代以1∶2的比例進行再次接種培養，記為P1代。P2代以后按1∶2或1∶3的比例傳代培養。倒置顯微鏡下觀察細胞形態并拍照。

1.2.2 誘導分化為多巴胺能神經元:將P3代臍帶MSCs以1×104個/孔密度接種24孔細胞培養板。培養24 h后更換神經誘導液［DMEM/F12、50 μg/ml Vitc、250 ng/ml SHH、100 ng/ml FGF8、50 ng/ml bFGF、N2(100×)］。誘導9 d后，再往誘導液中加入50 ng/ml的BDNF(加入BDNF時，24孔板中的誘導液不換)，繼續誘導3 d，每天觀察，拍照，未誘導的臍帶MSCs作為對照。

1.2.3 誘導后細胞凍存、復蘇與存活率檢測:凍存時，采集誘導后細胞加入含10%二甲基亞砜(DMSO)的細胞凍存液，混勻后轉入凍存管，放入4℃預冷程序降溫盒，-80℃冰箱過夜后轉入液氮中保存。復蘇時，取出細胞凍存管立即放入37℃水浴箱，輕度搖動令其快速融化，將融化的細胞懸液轉入含生理鹽水的離心管中，離心去上清。取部分復蘇細胞檢測存活率:將細胞與臺盼藍混勻，計算細胞存活率(%)=活細胞總數/(活細胞總數＋死細胞總數)×100%。

1.2.4 免疫熒光檢測β-微管蛋白Ⅲ、NeuN、TH、BDNF蛋白表達:將P3代臍帶MSCs以8×103/cm2的密度接種入鋪有蓋玻片的6孔板中培養24 h。采用上述神經誘導液誘導12 d后開始進行免疫熒光染色鑒定;已誘導的凍存細胞經復蘇后，在鋪有蓋玻片的6孔板中貼壁生長后即可進行免疫熒光檢測。4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBS清洗3次，每次3 min。加入含有0.1%TritonX-100的山羊血清室溫孵育30 min后，分別與β-微管蛋白Ⅲ抗體(稀釋濃度為1∶500)/TH(1∶1000)/NeuN(1∶100)/BDNF(1∶1500)孵育過夜;行熒光雙標時與一抗混合液孵育過夜:鼠抗-TH和兔抗-BDNF/兔抗-TH和鼠抗β-微管蛋白Ⅲ;加入 DAPI(稀釋濃度為1∶500)及相應二抗孵育120 min。熒光倒置顯微鏡觀察。隨機抽取3個視野進行細胞陽性率計數。

1.2.5 統計學分析:采用SPSS 13.0軟件進行統計學分析，數據以±s表示，各實驗組間比較用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臍帶MSCs誘導前后形態學觀察 傳代培養2～3代后，可見細胞形態較為一致，為細長梭形細胞，呈克隆樣生長。見圖1。

2.2 UCMSCs誘導后分化為多巴胺能樣神經元

2.2.1 細胞形態觀察:經誘導分化后可見細胞胞體變大，逐漸伸出突起并伸長，表現出神經細胞樣形態。見圖1。

圖1 臍帶MSCs誘導前后形態學觀察(×200)

2.2.2 免疫熒光鑒定神經細胞標記蛋白:對照組免疫熒光檢測結果表明，未誘導的MSCs可表達β-微管蛋白Ⅲ，陽性率為(21.24±0.97)%，但NeuN、TH和BDNF均無表達。誘導組免疫熒光檢測DA能神經元的特異性標志，TH陽性細胞表達率為(17.65±1.91)%;神經元標記物β-微管蛋白Ⅲ及NeuN陽性細胞比率分別為(55.54±11.67)%和(70.00±7.52)%，均較對照組明顯升高(P＜0.05)。用免疫熒光分別檢測2組細胞內BDNF表達情況，對照組中無BDNF表達，而誘導組細胞中可見BDNF表達，陽性細胞比率為(14.15±3.04)%。復蘇后的誘導細胞仍可穩定檢測到β-微管蛋白Ⅲ、TH和NeuN的表達(圖 2，3)。

2.2.3 已誘導細胞復蘇后細胞存活率檢測:細胞存活率為(92.5±1.83)%，復蘇后狀態良好，可在培養劑中正常生長。

3 討論

PD患病率在＞60歲老年人神經退行性疾病中位居第二，僅次于阿爾茨海默病，臨床表現為靜止性震顫、肌肉強直、運動遲緩、步態異常。中腦黑質DA能神經元的進行性變性、缺失和死亡是PD的主要病理改變。但是，目前的常規治療(包括內科及外科治療)僅能控制癥狀，并不能延緩、阻止PD病理的進展［1-2］。所以尋找針對PD的病因治療手段已成為當前該領域臨床研究的重點與難點。

干細胞是一類具有自我更新和多向分化潛能的細胞，能在體內存活，分泌細胞因子，并替代死亡或者衰老的細胞。此外，干細胞源性DA能神經元行移植治療還可補充腦內TH的不足，促進腦內DA的合成，因此，目前認為PD是最適合進行細胞替代治療(cell replacement therapy，CRT)的中樞神經系統退行性疾?。?］。目前認為，多種類型的干細胞都可向DA能神經元誘導分化，但臍帶MSCs有明顯的優越性，其來源廣泛、易培養、免疫源性小、無倫理道德爭議及移植后能夠長期存活，從而決定其可作為一種優秀的種子細胞［6］。

本實驗采用臍帶MSCs行兩步誘導法，首先應用SHH、FGF8、bFGF等特定細胞因子使其誘導分化形成成熟的神經元，分化比例約為70%，并可明顯表達β-微管蛋白Ⅲ及NeuN等神經元特異性標志物;再應用BDNF使其定向誘導分化形成多DA神經元，比例約為17.65%，并可明顯表達特異性TH，誘導效率良好。誘導細胞可通過低溫保存，復蘇后細胞存活率高達(92.5±1.83)%，且能夠穩定表達TH、β-微管蛋白 Ⅲ和NeuN。

本實驗檢測了誘導前后細胞中BDNF的表達，發現誘導前無BDNF表達，而誘導后細胞中可見明顯BDNF表達，且BDNF與TH共定位。大量研究表明，BDNF對DA能神經元有營養、促分化和保護作用，應用反義核酸阻斷BDNF表達可導致黑質內DA能神經元缺失［7-8］，提示 BDNF可能與 PD的發生和發展有關。同時有實驗證明，在PD模型鼠黑質內行人MSCs移植治療后，腦內BDNF含量明顯增高［9］。另外，在其他中樞神經系統疾病的細胞替代治療研究中發現BDNF與干細胞移植聯合治療效果優于單純干細胞移植治療［10］。目前普遍認同膠質細胞源性神經營養因子(glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)在干細胞治療PD時發揮了一定的作用，而近期的研究表明，在PD小鼠模型中，GDNF對DA能神經元的保護作用可能是通過上調Pitx3介導的細胞內BDNF合成而實現的［11］。上述研究均提示，BDNF能提高干細胞移植的療效并且可能是該療法的作用機制之一。我們對比了誘導前后細胞內BDNF的表達，HUCMSCs無表達，而誘導后細胞表達比率為(14.15±3.04)%。該結果提示，誘導后含部分DA能神經元的細胞可能較HUCMSCs更適合PD的細胞替代治療。

綜上所述，臍帶MSCs經特定的誘導劑作用后可部分定向分化為PA能神經元，此類DA能神經元內不僅能有效表達TH，還可表達BDNF，因此不僅有可能補充腦內DA的生成不足，還可能發揮神經營養與保護作用。我們的研究結果可能為今后應用此類細胞進行PD的細胞替代治療提供一定的理論基礎。然而，PD細胞替代治療的療效不僅取決于干細胞供體，可能還與其體內存活率、分化潛能以及微環境與干細胞的相互影響等因素有關。所以，仍需在今后的在體實驗中進一步觀察，以明確此類來源于HUCMSCs的DA能神經元在PD細胞替代治療中的真正作用。

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