老齡大鼠腦缺血/再灌注微血管生成及Ang/Tie－2系統的表達變化

劉 軻 李建生 郜利霞 宋張杰 楊歆科 韓向輝 劉敬霞 劉政國 周友龍

(河南中醫學院第一附屬醫院，河南 鄭州 450000)

研究證實〔1，2〕，腦梗死患者腦組織內存在不同程度新生微血管密度的增加，且血管密度高的腦梗死患者預后明顯好于血管密度低的患者，提示缺血區血管增生的范圍與程度直接關系到腦梗死患者的預后，新形成的側支血管可以改善缺血區周圍的組織灌流，可促進腦缺血后的神經功能恢復。因而，有關腦缺血后微血管生成作用機制的研究備受學者關注。近年來研究發現，血管生成素(Ang)及其受體酪氨酸激酶型受體(Tie-2)系統對腦缺血后微血管的生成發揮重要作用。本課題觀察腦缺血/再灌注(I/R)腦微血管密度(MVD)、血管場面積以及Ang/Tie-2系統的蛋白與基因的表達變化，探討Ang/Tie-2系統對腦IR損傷后腦微血管生成的影響及促血管生成的特點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SD雄性青年大鼠5～6月齡44只，300～350 g，動物合格證號:醫動字第410117號，SD雄性老齡大鼠20～21月齡 44只，450～600 g，動物合格證號:醫動字第410117號，由河南省實驗動物中心提供。動物在安靜環境下分籠飼養，室溫控制在26℃ ±1℃的范圍內，相對濕度40% ～60%，每天給予充足的清潔飲水和飼料。

1.2 主要試劑與儀器 兔抗鼠單克隆抗體CD34、過氧化酶SP試劑盒由福州邁新生物技術開發公司提供;兔抗鼠單克隆Ang-1抗體、兔抗鼠單克隆Ang-2抗體、兔抗鼠單克隆Tie-2抗體及Ang-1原位雜交檢測試劑盒、Ang-1原位雜交檢測試劑盒、Tie-2原位雜交檢測試劑盒均由武漢博士德生物工程有限公司

提供;Olympus BX51顯微鏡、Olympus DP70圖像采集系統均由日本奧林巴斯株式會社生產;Image-Pro Plus 5.1圖像分析系統由美國Media Cybernetics公司提供。

1.3 動物分組與處理 本實驗設青年假手術組、青年模型組(根據 I/R 時間不同又分為 I 3 h，I/R 1、3、6、12 d 組);老齡假手術組、老齡模型組(觀察時點同青年模型組)。青年大鼠按隨機數字表分組，老齡大鼠按體重結合隨機數字分組，每組每個時點6只。

1.4 模型制備 參照Longa等〔3，4〕報道的方法加以改進。

1.5 指標觀察與檢測方法

1.5.1 微血管密度(MVD)及血管場面積檢測 采用免疫組織化學染色法。常規石蠟切片厚5 μm，5%正常山羊血清封閉，室溫孵育10 min。傾去血清，滴加一抗，37℃孵育1 h，PBS沖洗。滴加生物素標記二抗，37℃孵育10～30 min。滴加適當比例稀釋的辣根酶標記鏈霉卵白素，DAB顯色。陰性對照組用PBS代替一抗進行孵育。血管內皮細胞膜棕黃色顆粒者為CD34染色陽性。凡呈現單個內皮細胞或內皮細胞簇者均為一個血管計數，管腔大于8個紅細胞直徑，或帶有較厚基層的血管均不計數。選取大腦皮質缺血周邊區、中心區每個區域內5～10個鏡下高倍視野(400倍)進行血管計數，表示MVD。采用全自動彩色圖像處理系統測定血管場面積比，血管場面積比為所測有效血管截面面積與統計場面積的千分比。

1.5.2 Ang-1、Ang-2和Tie-2蛋白檢測 采用免疫組化法測定，常規石蠟切片厚5 μm。3%H2O2室溫孵育10 min，5%正常山羊血清封閉，室溫孵育10 min。傾去血清，滴加一抗，37℃孵育1 h，PBS沖洗。滴加生物素標記二抗，37℃孵育10～30 min。滴加適當比例稀釋的辣根酶標記鏈霉卵白素，DAB顯色。陰性對照采用PBS替代第一抗體進行。胞漿或胞膜棕黃色染色者為陽性細胞。在大腦皮質缺血周邊區、中心區選取5～10個高倍鏡下(400倍)視野進行觀察并攝片。采用全自動彩色圖像處理系統進行圖像分析，測定陽性反應的灰度值。1.5.3 Ang-1、Ang-2和Tie-2 mRNA檢測 采用原位雜交法檢測，常規脫水、浸蠟、包埋，胃蛋白酶消化后固定，進行預雜交，然后雜交，滴加生物素化鼠抗地高辛，滴加生物素化SP，DAB顯色，雜交結果進行分析，并采用全自動彩色圖像處理系統進行圖像分析，測定陽性反應的灰度值。

2 結果

2.1 各組大鼠MVD及血管場面積變化 青年模型組I/R 1、3、6、12 d大鼠MVD均高于青年假手術組(P＜0.01)，老齡模型組I/R 6、12 d大鼠MVD均低于老齡假手術組(P＜0.05，P＜0.01);與青年組同時間點比較，老齡假手術組MVD增高(P＜0.01)，老齡模型組 I/R 1、3、6、12 d大鼠 MVD 均降低(P ＜0.05，P＜0.01)。老齡模型組大鼠MVD自缺血3 h持續降低至I/R 12 d;青年模型組大鼠MVD于缺血3 h開始增高，I/R 6 d達高峰，持續至 I/R 12 d。青年模型組 I/R 1、3、6、12 d 大鼠血管場面積均高于青年假手術組(P＜0.01)，老齡模型組I/R 1 d大鼠血管場面積高于老齡假手術組(P＜0.05);與青年動物組相同時間點比較，老齡模型組I/R 1、3、6、12 d大鼠血管場面積均降低(P＜0.01)。青年模型組I/R 1 d大鼠血管場面積明顯增高，I/R 1～6 d逐漸降低，至I/R 12 d又明顯增高;老齡模型組大鼠血管場面積于I/R 1 d達峰值，后逐步降低。見表1。

表1 各組大鼠MVD、血管場面積變化比較(，n=6)

表1 各組大鼠MVD、血管場面積變化比較(，n=6)

與同齡假手術組比較:1)P＜0.01，2)P＜0.05;與青年假手術組比較:3)P＜0.01;與青年I/R同時間點比較:4)P＜0.05，5)P＜0.01

組別 時點 MVD(個) 血管場面積(‰)青年假手術組5.50±1.53 23.37±7.90青年模型組 I 3 h 5.96±1.65 27.16±5.55 I/R 1 d 7.50±1.871) 36.27±12.241)I/R 3 d 9.75±2.311) 35.17±10.481)I/R 6 d 10.13±2.091) 31.34±8.331)I/R 12 d 10.00±1.961) 39.42±14.301)老齡假手術組 6.88±1.603) 23.97±5.46老齡模型組 I 3 h 6.63±1.53 25.10±6.58 I/R 1 d 6.50±1.594) 28.24±5.682)I/R 3 d 6.04±1.275) 24.97±7.115)I/R 6 d 5.71±1.762)5) 21.83±6.685)I/R 12 d 5.29±1.121)5) 20.64±6.565)

2.2 各組大鼠Ang-1、Ang-2及Tie-2表達變化 見表2。

2.2.1 Ang-1表達變化 青年及老齡模型組I/R 1、3、6、12 d大鼠Ang-1表達均高于青年及老齡假手術組(P＜0.01);青年及老齡模型組大鼠Ang-1表達均隨再灌注時間延長而逐漸增高，于I/R 3 d達到峰值，其后逐漸降低;與青年動物組相同時間點比較，老齡動物組各時間點Ang-1表達均降低(P＜0.01，P ＜0.05)。

2.2.2 Ang-2表達變化 青年及老齡模型組各時間點大鼠Ang-2表達均高于較青年及老齡假手術組(P＜0.01);青年模型組Ang-2表達持續增高到I/R 3 d達峰值，I/R 3～12 d表達逐漸降低;老齡模型組Ang-2隨再灌注時間延長表達逐漸增高，I/R 1 d達到峰值，逐步降低至I/R 3 d，至I/R 6 d表達又稍有增高，此后明顯降低;與青年動物組相同時間點比較，老齡動物組I/R 1 d大鼠Ang-2表達增高(P＜0.01)，其余各時間點Ang-2表達均降低(P＜0.01)。

2.2.3 Tie-2表達變化 青年模型組 I3 h、I/R 1、3、6 d大鼠Tie-2表達均高于青年假手術組(P＜0.01，P＜0.05)，老齡模型組I3 h、I/R 1、3 d大鼠Tie-2表達均高于老齡假手術組(P＜0.01，P＜0.05);青年和老齡模型組Tie-2表達均隨再灌注時間的延長而逐步增高，老齡模型組提前至I/R 1 d達峰值，此后老齡模型大鼠表達迅速降低，而青年模型組至I/R 12 d仍維持一個相對高的表達水平。與青年動物組相同時間點比較，老齡動物組I/R 3、6、12 d大鼠Tie-2表達降低(P＜0.01)。

2.3 各組大鼠Ang-1 mRNA、Ang-2 mRNA及Tie-2 mRNA表達變化 見表3。

2.3.1 Ang-1 mRNA表達變化 青年及老齡模型組I/R 1、3、

6、12 d大鼠Ang-1 mRNA表達均高于青年及老齡假手術組(P＜0.01);青年及老齡模型組大鼠Ang-1 mRNA表達均隨再灌注時間延長而逐漸增高，于I/R 3 d達到峰值，其后逐漸降低;與青年動物組相同時間點比較，老齡動物組各時間點Ang-1 mRNA表達均降低(P＜0.01，P＜0.05)。

2.3.2 Ang-2 mRNA表達變化 青年和老齡模型組各時間點大鼠Ang-2 mRNA表達均高于老齡假手術組(P＜0.05，P＜0.01);青年和老齡模型組隨再灌注時間的延長表達逐步增高，I/R 1 d達到峰值，老齡大鼠I/R 1～3 d表達逐步降低，I/R 3～12 d表達又逐步增高，而青年大鼠I/R 1～6 d表達逐步降低，I/R 6～12 d表達逐步增高。與青年動物組相同時點比較，老齡假手術組、老齡模型組I 3 h、I/R 1、3、12 d表達水平均降低(P ＜0.05，P ＜0.01)。

2.3.3 Tie-2 mRNA表達變化 青年模型組各時間點大鼠Tie-2 mRNA表達均低于青年假手術組(P＜0.01)，老齡模型組I 3 h、I/R 1、3 d大鼠 Tie-2 mRNA表達均高于青年假手術組(P＜0.05，P＜0.01);青年和老齡模型組Tie-2表達均隨再灌注時間的延長而逐步增高，二者均于I/R 3 d達峰值，此后老齡模型大鼠表達迅速降低，而青年模型組至I/R 12 d仍維持一個相對高的表達水平;與青年動物組相同時間點比較，老齡動物組各時間點Tie-2 mRNA表達均降低(P＜0.05，P＜0.01)。

表2 各組大鼠Ang-1、Ang-2及Tie-2表達變化(，n=6)

表2 各組大鼠Ang-1、Ang-2及Tie-2表達變化(，n=6)

組別 Ang-1(灰度值) Ang-2(灰度值) Tie-2(灰度值)青年假手術組178.75±4.36 187.71±2.74 182.98±5.04青年模型組I 3 h 188.14±5.211) 176.02±4.841) 175.77±3.332)I/R 1 d 172.10±4.112) 165.63±1.811) 169.88±4.251)I/R 3 d 160.39±3.521) 141.24±1.281) 161.11±2.511)I/R 6 d 166.77±3.991) 149.80±3.961) 170.76±3.371)I/R 12 d 170.31±2.152) 162.51±2.401) 179.88±3.40老齡假手術組 182.01±3.773) 194.53±4.333) 190.76±3.443)老齡模型組I 3 h 195.18±5.181) 185.98±4.451) 181.56±5.212)I/R 1 d 179.02±5.162)5) 150.53±5.451)5) 163.95±4.381)4)I/R 3 d 162.45±2.921) 171.27±3.901)5) 174.29±3.621)5)I/R 6 d 170.73±3.151) 159.73±3.171)5) 189.62±4.825)I/R 12 d 175.85±3.031)4) 177.85±3.011) 198.29±6.872)5)

表3 各組大鼠Ang-1 mRNA、Ang-2 mRNA及Tie-2 mRNA表達變化(，n=6)

表3 各組大鼠Ang-1 mRNA、Ang-2 mRNA及Tie-2 mRNA表達變化(，n=6)

組別Ang-1 mRNA(灰度值)Ang-2 mRNA(灰度值)Tie-2 mRNA(灰度值)青年假手術組179.70±6.20 188.81±6.20 181.37±4.93青年模型組I 3 h 190.31±6.301) 169.96±6.031) 171.85±4.781)I/R 1 d 167.40±8.291) 130.51±11.301) 163.90±5.631)I/R 3 d 155.84±5.791) 146.52±7.381) 149.96±5.201)I/R 6 d 160.06±7.001) 163.07±6.881) 166.46±5.011)I/R 12 d 169.98±7.071) 146.08±4.741) 170.91±4.701)老齡假手術組 191.40±4.043) 213.96±4.273) 185.80±4.95老齡模型組I 3 h 204.68±5.091) 200.22±7.742) 178.78±2.372)I/R 1 d 182.86±7.391)5) 145.51±7.831)4) 169.63±6.661)4)I/R 3 d 162.88±9.351)4) 177.94±4.711)5) 158.95±6.141)5)I/R 6 d 173.92±6.251)5) 169.84±11.051)5) 187.83±7.895)I/R 12 d 183.19±7.571)5) 163.22±7.981)5) 194.22±4.911)5)

3 討論

腦缺血后的血管生成是一個復雜的精細的調控過程，研究證實〔5〕，腦缺血后機體“自身代償性血管生成”所形成的側支循環，是由局部組織釋放的內源性促血管生長因子所引起的，這些因子在腦缺血后微血管生成過程中發揮著重要作用。Plate〔6〕亦認為腦血管生成受神經外胚胎層來源的血管生成生長因子與內皮細胞上表達的酪氨酸激酶受體結合而調節。大鼠腦血管生成在出生20 d后即可完成，但在病理情況下，如腦血管缺血、缺氧、腦腫瘤生長，內皮細胞在成年后仍可增殖，血管的增殖有賴于血管生長因子的表達和相互協同。在此過程中，這些因子及其受體家族通過不同途徑的協同作用，促進腦缺血后的血管生成和腦損傷的恢復，其中有關Ang及其受體Tie-2的研究備受關注。

Ang是一組特異性作用于血管內皮細胞的生長因子，該家族主要由Ang-1、Ang-2、Ang-3和 Ang-4四種因子組成，其中Ang-1與Ang-2具有同源性，與血管生成關系密切。Ang受體Tie是血管內皮細胞上特異的酪氨酸激酶型受體，Tie-1和Tie-2是該家族的2個主要成員，目前研究發現Tie-1不具備酪氨酸激酶功能，尚未發現其相應的配體，而Tie-2受體能被其配體Ang家族識別，Ang-1和Ang-2能特異性與Tie-2結合，在血管生成中Ang/Tie系統通過正負協同作用進行調節。目前研究認為Ang-1為Tie-2受體的激動劑，Tie-2與Ang-1結合后，使其磷酸化而被激活，在血管生成中的作用主要是〔7～13〕:①抑制內皮細胞的凋亡，促進細胞的存活;②抑制內皮細胞的通透性;③促進血管的芽生和分支，募集內皮周圍支持細胞，促進血管重塑和成熟，形成完整的細胞壁，維持血管的完整性和穩定性。Ang-2同樣特異結合于血管內皮Tie-2受體，大多數研究發現Ang-2是Tie-2受體的拮抗劑，Ang-2與 Tie-2受體結合后，競爭性的抑制Ang-1激活Tie-2的效應，引起血管穩定的破壞，促使血管結構松解，解除血管周細胞、胞外基質對內皮的抑制，促進血管退化〔14，15〕。但由于Ang-2破壞內皮細胞與外周基質間的作用，使不穩定狀態的血管內皮、基質對生長因子的敏感性增強，又可以加強VEGF的促血管生成作用，從而誘導血管重建。而最近研究顯示〔14，15〕，Ang-2 可能在缺少 Ang-1、延長 Ang-2 作用時間或加大濃度等特定情況下也可激活Tie-2。Ang/Tie系統通過相互協調作用參與血管生成的調節過程。另外，MVD表示的是單位面積內血管的數量，血管場面積為一個視野內所有微血管管腔面積陽性染色總和與背景視野面積的比值，可較為客觀地反映微血管管腔大小。血管數量及管腔粗細為反映血流量及血管有效性的重要指標，故對此兩指標進行觀察，能較全面地反映血管生成的全貌。因此，本實驗為了更好闡釋Ang/Tie系統對血管生成的調節作用，同時對MVD及血管場面積進行了研究。

本研究結果說明腦缺血損傷后青年大鼠不僅血管數量有增加，而且血管腔直徑也增粗，血液供給量明顯改善。而老齡模型組大鼠血管場面積于I/R 1 d時達峰值，隨后逐步降低，說明了老齡大鼠腦MVD降低的同時也伴隨有血管腔徑的明顯縮小，從而使血液有效灌注量降低。

本實驗中，青年與老齡模型組Ang/Tie-2表達主要在血管內皮細胞上，而且集中于缺血半暗帶區，這可能是在損傷早期缺血中心區的細胞在缺氧誘導因子(HIF)的作用下促使Ang/Tie-2的表達，由于缺血中心區與半暗帶區之間存在著氧濃度梯度，隨著缺血時間的延長，中心區細胞很快崩解壞死，而缺血半暗帶區仍屬于保存能量代謝的部位，HIF可持續在此區表達，從而引起Ang/Tie-2的表達向缺血半暗帶區轉移。由此我們認為，在一定程度上Ang/Tie-2的表達上調與缺血缺氧因素有關。另外，結合青、老齡模型組大鼠MVD變化規律，我們發現老齡大鼠腦缺血損傷初期MVD較青年大鼠增多，可能由于增齡的因素，老齡大鼠血管變脆變硬，腦組織缺血缺氧逐漸加重，而缺血缺氧又為促Ang/Tie-2表達的因素，在此因素的作用下，為抵御腦缺血改變，老齡大鼠腦組織內逐漸有新血管形成。

本研究動態觀察了Ang/Tie-2系統表達變化，免疫組化結果顯示:青年模型組I3h大鼠Ang-1的表達下調，而Ang-2及受體Tie-2的表達均于13 h即表達上調，此后Ang-1、Ang-2、Tie-2三者表達均上調至I/R 3 d達高峰，隨后稍有下降，仍保持較高水平的表達(僅于所選取的時間點內觀察結果);而老齡模型組大鼠Ang-1、Ang-2及受體Tie-2的表達于I/R 1 d或3 d至高峰，隨后迅速下降。由本實驗結果我們推測，在缺血早期大鼠Ang-1與Ang-2、Tie-2的表達規律似乎不一致，這可能與Ang-2的表達上調有關，由于Ang-2是Ang-1的天然拮抗劑，可以競爭性抑制Ang-1與Tie-2的結合，然而在缺乏Ang-1的條件下，Ang-2則發揮激活Tie-2的作用，致使Tie-2隨著Ang-2的表達上調而增加，這一結果與Yuan等〔14〕研究基本一致，此后隨著Ang-1、Ang-2等相關血管生長因子的表達上調至高峰，Tie-2的表達亦隨之達峰值，表明它們相互作用和影響，在時間上協同調節血管生成。此外，本實驗中，與青年大鼠相比，老齡大鼠Ang/Tie-2表達峰值提前，此可能與老齡大鼠腦I/R后損傷重，細胞凋亡變性快，組織超微結構破壞嚴重等有關。

本實驗中原位雜交結果顯示:青年及老齡模型組大鼠Ang-1 mRNA、Tie-2 mRNA的表達均于I/R 3 d至高峰，隨后表達降低但仍保持較高水平，Ang-2mRNA于I/R 1d至高峰，此后Ang-2 mRNA表達逐漸降低，后又逐步增強的趨勢。Lin等〔16〕的研究表明，在大鼠局灶性腦梗死后，Ang-1 mRNA表達在再灌注1 w后才明顯增加，2 w后可達正常值的8倍;Ang-2 mRNA表達呈現兩個峰值的變化，第一個高峰在腦梗死后24 h，此時Ang-2 mRNA表達是正常值的6.4倍，至72 h后開始下降但仍保持在底線水平;第二高峰在2周后出現，此時Ang-2 mRNA表達是正常值的4.6倍;Tie-2 mRNA則于再灌注24 h后開始升高且持續維持至2 w后。本實驗結果與Lin等〔16〕的研究似乎不甚一致可能由于時間點的選取、環境、取材，動物品種及模型等不同所引起的，尚待進一步研究。本實驗表明當面臨相同條件的腦缺血損傷后，老齡大鼠腦組織由于退行性改變，可能對缺血缺氧應激反應減弱，對Ang/Tie-2表達的調控能力明顯降低。結合上述研究結果，通過對蛋白與基因之間比較發現，隨著增齡，老齡大鼠Ang/Tie-2系統基因表達明顯減弱，這與因增齡變化而表現出的細胞因子表達下降的規律基本一致，由此可知，Ang/Tie-2系統基因的表達在一定程度上直接調控著其蛋白表達的多少。

綜合上述研究結果表明，腦I/R損傷后青、老齡大鼠在Ang/Tie-2系統的表達上均有明顯自身的特點，表現為青年大鼠達高峰后仍維持較高水平，而老齡大鼠Ang/Tie-2系統于I 3 h開始表達，I/R1d或I/R 3 d達高峰，峰值過后迅速下降，這與青年大鼠I/R后腦MVD和血管場面積的逐漸增加，老齡大鼠腦MVD和血管場面積持續降低的規律基本吻合。在腦缺血損傷初期老齡大鼠腦組織受到缺血缺氧刺激，使Ang/Tie-2系統的表達上調，進而引起微血管代償性增殖，出現新的微血管再生，微血管數量相對增加，但隨著腦I/R時間的延長，老齡大鼠腦組織面臨缺血損傷較重，對缺血缺氧應激反應減弱，Ang/Tie-2系統表達逐漸降低，對微血管再生的調控能力也隨之減弱，微血管增值能力明顯降低故血管生成逐漸下降。總之，可以證實，腦I/R后腦微血管生成與Ang/Tie-2系統的表達密切相關，隨著腦I/R時間的延長，老齡大鼠微血管生成能力的逐漸降低，其機制可能與老齡大鼠腦I/R后Ang/Tie-2系統蛋白與基因的表達明顯減弱有關，提示增齡是影響老齡大鼠Ang/Tie-2系統的表達重要因素之一。

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