嗜熱鏈球菌codY基因啟動子的克隆及功能驗證

劉 芳， 都立輝， 王道營， 徐為民， 霍貴成

(1.江蘇省農業科學院農產品加工研究所，江蘇 南京 210014;2.南京財經大學食品科學與工程學院，江蘇 南京 210003;3.東北農業大學乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030)

乳酸菌被公認為安全的食品級微生物，在食品和醫藥領域中的應用越來越廣泛，并被用來外源表達某些功能物質［1－4］。但乳酸菌的表達載體很少，尤其是具有特殊用途的表達載體更少，限制了乳酸菌生物工程的發展。目前應用最廣泛的乳酸菌表達系統是NICE(Nisin－controlled expression)系統，它是在乳鏈菌肽誘導下由nisA啟動子控制目的基因表達，并且需要nisR和nisK基因的存在［5］。雖然該系統可以實現外源物質的高效表達［6］，但是由于大多數乳酸菌不攜帶nisR和nisK基因，需要在乳酸菌染色體上整合nisR和nisK基因或者使用雙質粒系統，這限制了NICE系統的應用。在乳酸菌內進行外源基因表達時也可選擇組成型表達載體，但這類載體的啟動子不受調控，菌株開始生長時，外源物質也隨之表達，對菌株造成一些負擔或毒性，影響菌株的生長。因此，如果能夠找到一種自身調控的啟動子來構建乳酸菌的表達載體，必將擴展乳酸菌的應用范圍。

根據已有研究，乳酸乳球菌MG1363含有一個轉錄調控元件CodY，它能調控蛋白水解系統中相關基因的表達，當細胞內支鏈氨基酸(包括異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸)的濃度增大時，CodY能夠結合到蛋白水解系統相應基因操縱子的上游序列，從而控制這些基因的表達［7］。同時，研究還證實CodY能夠調節它自身的合成，并且也需要支鏈氨基酸結合到該蛋白質的啟動子上［8］。因此，當菌株生長到對數生長期，胞內游離氨基酸尤其是支鏈氨基酸的濃度增大時，CodY開始表達。通過嗜熱鏈球菌基因組信息(NC_006449和NC_008532等)推斷，該菌內也含有一個類似的調控蛋白CodY，但是對該蛋白質在嗜熱鏈球菌中的調控機制還沒有深入的研究。由于嗜熱鏈球菌是酸奶發酵菌株，應用潛力巨大，因此對嗜熱鏈球菌進行研究有很重要的生產價值。

為了明確能否利用嗜熱鏈球菌CodY蛋白的啟動子來調控外源基因的表達，本試驗擬首先克隆出CodY的啟動子，利用該啟動子和嗜熱鏈球菌內源性質粒的復制子構建嗜熱鏈球菌用表達載體，然后以gusA基因為報告基因，研究嗜熱鏈球菌來源的codY基因啟動子是否能夠調控下游基因的表達，旨在為嗜熱鏈球菌的生物工程研究提供新的研究方法和操作工具。

1 材料與方法

1.1 菌株、質粒、培養基和培養條件

大腸桿菌(E.coli DH5α)和嗜熱鏈球菌(KLDS 3.8501和KLDS 3.0503)來源于乳品工業微生物菌種保藏中心(KLDS－DICC);乳酸乳球菌 NZ9000購自荷蘭NIZO食品研究所;克隆載體pMD19－T simple購自寶生物工程(大連)有限公司;pNZ273由 Jean－Christophe Giard教授饋贈。

E.coli DH5α用LB培養基，37℃振蕩培養;乳酸乳球菌用GM17培養基(M17培養基外加0.5%葡萄糖)，30℃靜止培養。嗜熱鏈球菌用LM17培養基(M17培養基外加2%乳糖)，42℃靜止培養。氨芐青霉素、氯霉素在大腸桿菌中的使用濃度分別為 100 μg/ml和 25 μg/ml，氯霉素在乳酸乳球菌和嗜熱鏈球菌中的使用濃度都為5 μg/ml。

1.2 試劑

細菌基因組提取試劑盒和質粒小量提取試劑盒均購自天根生化科技有限公司;膠回收試劑盒購自上海華舜生物工程有限公司;PCR引物的合成以及DNA序列的測定由上海生工生物工程有限公司完成;限制性核酸內切酶 BglⅡ、PstⅠ、SalⅠ、SacⅠ、HindⅢ和 XhoⅠ，PrimeSTAR?HS DNA Polymerase購于寶生物工程(大連)有限公司;T4 DNA連接酶購于NEB公司;氯霉素和對硝基苯－β－D－葡萄糖酸(PNPG)購自 Sigma 公司;5－溴－4－氯－3－吲哚葡糖苷酸(X－Gluc)由Clontech公司提供;M17培養基購自BD公司，其余試劑為分析純。

1.3 嗜熱鏈球菌codY基因啟動子的擴增

由在線啟動子分析軟件BDGP(http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)預測codY基因啟動子所在的范圍。利用引物Co7(5'－TAAGAGATCTATTCGTGAAAACTGGAC－3')和 Co8(5'－CCATCTGCAGTGTCTTCACTTTCTATT－3')，以嗜熱鏈球菌KLDS 3.0503的基因組為模板擴增該基因的啟動子。將大小為273 bp的PCR產物連入克隆載體pMD19－T simple后熱轉E.coli DH5α感受態細胞后測序。

1.4 pNZ273/codY質粒的構建

將codY基因啟動子的PCR回收產物和pNZ273質粒分別用內切酶BglⅡ和PstⅠ雙酶切后連接，將連接產物熱轉入E.coli DH5α，重組質粒通過BglⅡ和PstⅠ雙酶切和PCR反應進行鑒定。將連接正確的質粒定名為 pNZ273/codY。接著，將重組質粒pNZ273/codY電轉化入乳酸乳球菌NZ9000中［9］，通過5 μg/ml氯霉素篩選陽性克隆子。

1.5 嗜熱鏈球菌內源性質粒的提取和序列測定

嗜熱鏈球菌KLDS3.8501內源性質粒的提取采用天根公司的質粒小量提取試劑盒進行，經過以下修改:將菌體離心后重懸于含有30 mg/ml溶菌酶的STE緩沖液中，37℃溫育20 min［10］，其余操作按照說明書進行。然后，回收其中的小質粒，將該質粒命名為 p3.8501－1。分別利用 BglⅡ、EcoRⅠ、HindⅢ、SacⅠ和SalⅠ單酶酶切質粒p3.8501－1，以分析其含有的酶切位點。選取其中一個酶的酶切質粒，回收酶切后的線性片斷連入克隆載體測序。然后，根據已測部分序列設計引物對整個質粒測序［11］。

1.6 嗜熱鏈球菌表達載體的構建

根據質粒p3.8501－1全基因序列信息及序列分析結果，在復制蛋白質編碼基因的兩側設計引物Stpr－up2(5'－AGTCTCGAGGTATTATGTCTTTGAAATTG－3')和 St－pr－down2(5'－CTTGTCGACTAATTAAAAATTACGAAAAG－3')，利用PCR擴增的方法來獲取復制子片段。PCR產物大小約為3 000 bp。

利用引物 Co23(5'－GTACTCGAGAAGCTTCACCG－3')和 Co24(5'－CACGTCGACCAACAATTTAGAT－3')從質粒pNZ273/codY中擴增出含有氯霉素抗性基因、codY啟動子和gusA基因序列的片斷。PCR產物大小約為2 800 bp。

將以上2個PCR產物回收后，分別利用SalⅠ和XhoⅠ進行雙酶切，然后利用T4 DNA連接酶將2個片斷進行連接。連接產物電轉化入無質粒的嗜熱鏈球菌 KLDS3.0503 中［12］，利用 5 μg/ml氯霉素篩選陽性克隆子，將陽性重組質粒命名為pST1。

1.7 codY基因啟動子的啟動效果驗證

1.7.1 在乳酸乳球菌NZ9000中的啟動效果驗證

將攜帶有重組質粒pNZ273/codY的乳酸乳球菌NZ9000轉化子轉接到含有終濃度為0.5 mmol/L 5－溴－4－氯－3－吲哚－β－D－葡糖苷酸(X－Gluc)的 GM17 固體培養基上，過夜培養后檢測 gusA基因是否表達［9］。

1.7.2 在嗜熱鏈球菌KLDS3.0503中的啟動效果驗證 將攜帶有重組質粒pST1的嗜熱鏈球菌KLDS3.0503轉化子轉接到含有終濃度為0.5 mmol/L X－Gluc的LM17固體培養基上，過夜培養后檢測gusA基因是否表達［9］。

1.7.3 不同培養時間內Gus酶的表達情況確定以對硝基苯－β－D－葡萄糖酸為 β－葡糖苷酸酶(Gus酶)的底物，接種乳酸乳球菌NZ9000/pNZ273/codY和嗜熱鏈球菌KLDS3.0503/pST1過夜培養物，接種量為2%，檢測不同培養時間內Gus酶的表達情況［9，13］。

2 結果

2.1 嗜熱鏈球菌codY基因啟動子的擴增

以嗜熱鏈球菌KLDS 3.0503基因組為模板，擴增出codY基因啟動子對應的片段(圖1)，同天根的MarkerⅢ相比，大小略大于200 bp，同目的條帶大小相同(273 bp)，測序結果正確。

圖1 codY基因啟動子的PCR擴增產物Fig.1 PCR product of the codY promoter

2.2 pNZ273/codY質粒的構建

重組質粒經BglⅡ和PstⅠ雙酶切后，獲得了兩條大小分別為4 500 bp和200 bp左右的片斷。以該質粒為模板，使用引物Co7和Co8進行PCR反應后也得到了大小在200 bp左右的片斷，這說明codY基因啟動子已連入啟動子探針型載體pNZ273的gusA基因前，即 pNZ273/codY質粒構建成功。將pNZ273/codY質粒電轉入乳酸乳球菌NZ9000中，獲得陽性克隆子。

2.3 嗜熱鏈球菌內源性質粒的提取和序列測定

嗜熱鏈球菌KLDS 3.8501內源性質粒圖譜如圖2所示，可以看出，該菌株含有多個質粒。將其中最小的質粒p3.8501－1回收，選擇不同的酶分別酶切該質粒，確定該質粒的酶切圖譜，結果如圖3所示，可以看出，該質粒能被BglⅡ、EcoRⅠ、HindⅢ酶切，而不能被SacⅠ和SalⅠ酶切。

圖2 嗜熱鏈球菌KLDS3.8501內源性質粒圖譜Fig.2 Plasmid profile of Streptococcus thermophilus KLDS3.8501

圖3 質粒p3.8501-1酶切圖譜Fig.3 Profile of the plasmid p3.8501-1 analyzed by restriction enzyme

大量提取質粒p3.8501－1后，選取HindⅢ酶切該質粒，回收大小在800 bp左右的片斷，連入克隆載體測序，然后根據已測序列設計引物，對整個質粒測序。結果發現，該質粒大小為3 361 bp，與NCBI上公布的嗜熱鏈球菌LMD－9 plasmid 2(NC_008501)的序列基本相同(預測到的復制區域完全相同)，復制方式為滾環復制。

2.4 嗜熱鏈球菌表達載體的構建

由于pNZ273的復制子是pSH71，它在嗜熱鏈球菌中不能穩定存在，很容易丟失，因此本試驗試圖使用嗜熱鏈球菌菌株內穩定遺傳的p3.8501－1質粒的復制子來構建表達載體。

質粒p3.8501－1的復制子區段的PCR擴增產物經瓊脂糖電泳后在3 000 bp左右有一條片斷出現，與預期片斷長度相同。從質粒pNZ273/codY中擴增出含有氯霉素抗性基因、codY啟動子及gusA基因的DNA片段，電泳結果符合預期大小。

將以上獲得的2個PCR產物通過SalⅠ和XhoⅠ雙酶切后連接，將連接液電轉化入KLDS 3.0503的感受態細胞中，通過5 μg/ml氯霉素篩選陽性克隆子。重組質粒經SalⅠ和XhoⅠ雙酶切后分別在3 000 bp和2 800 bp左右有相應條帶出現，表明重組質粒pST1構建成功。該質粒的物理遺傳圖譜如圖4所示。

圖4 pST1質粒的物理遺傳圖譜Fig.4 Physical and genetic map of plasmid pST1

2.5 codY基因啟動子的啟動效果驗證

將乳酸乳球菌NZ9000/pNZ273/codY和嗜熱鏈球菌KLDS3.0503/pST1的菌落分別轉接到含有終濃度為0.5 mmol/L X－Gluc的 GM17和 LM17固體培養基上，過夜培養后，NZ9000/pNZ273/codY和KLDS3.0503/pST1的菌落全部顯示藍斑，這說明codY啟動子在這2種菌內均能啟動下游gusA基因的表達，產生的β－葡糖苷酸酶分解了X－Gluc的葡萄糖苷酸糖苷鍵產生藍色沉淀。然后，以對硝基苯－β－D－葡萄糖酸為底物，測定了2種重組菌在不同培養時間內β－葡糖苷酸酶的活性，結果如圖5所示。可以看出，對于由codY啟動子誘導β－葡糖苷酸酶表達的菌株來說，在培養的前2 h內，沒有檢測到β－葡糖苷酸酶的活性;4 h后才能檢測到該酶活性的表達，此時菌株正好處于對數生長期。

圖5 2種重組菌在不同培養時間內β-葡糖苷酸酶的活性Fig.5 Activities of β-glucuronidases in the two recombinant strains cultured for different time

3 討論

研究一些基因在不同時間內的表達情況多采用熒光定量PCR的方法，但是對于乳酸菌來說，因其是革蘭氏陽性菌，細胞壁不易裂解，因此RNA的提取不方便，且易降解，同時需在不同培養時間內取樣提取RNA后進行研究，這樣既加大了勞動量也增加了試驗成本。為了研究嗜熱鏈球菌中CodY蛋白在不同培養時間內的表達量，以弄清其自身的調控機制，本試驗選取了一個新的研究方法，借助于啟動子探針型載體pNZ273，將該蛋白的啟動子插入報告基因gusA前，通過檢測不同時間內Gus酶的活性來間接反映CodY蛋白的表達。首先構建了乳酸乳球菌表達載體pNZ273/codY。由于pNZ273的復制子是SH71，在嗜熱鏈球菌中不能穩定復制，因此將pNZ273的復制子替換成嗜熱鏈球菌內源性質粒的復制子，成功構建了嗜熱鏈球菌的表達載體pST1。通過檢測不同培養時間內乳酸乳球菌NZ9000/pNZ273/codY和嗜熱鏈球菌KLDS3.0503/pST1的Gus酶活，結果發現當菌株生長到對數生長期時gusA基因才開始表達，這說明嗜熱鏈球菌的codY基因啟動子具有自身的調控作用，使得下游基因在菌株的對數生長期才開始表達。這就克服了以往組成型啟動子的缺點，避免了菌株在生長初期就承受表達外源蛋白的負擔或毒性作用。并且，由于codY啟動子具有自身調控的特點，這就省去了外源添加物的誘導和一些特殊基因的限制。

試驗中在兩種菌內測得的β－葡糖苷酸酶的表達量都不是很高，最高值也只有 9.6 nmol/(min·mg)。這說明codY啟動子不是一種強啟動子，但是如果需要在乳酸菌內表達某些功能基因，而對其表達量要求不很高時，該啟動子是一個很好的選擇。

本試驗利用嗜熱鏈球菌轉錄調控蛋白CodY的啟動子成功構建了兩個乳酸菌表達載體pNZ273/codY和pST1。在乳酸乳球菌和嗜熱鏈球菌中，該啟動子都能啟動下游gusA基因的表達，并且當菌株生長到對數生長期時，才檢測到β－葡糖苷酸酶的活性，這說明codY啟動子憑借自身的調控機制可以起到誘導型啟動子的作用。

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