γ-分泌酶抑制劑對姜黃素后處理心肌保護作用的影響

王 寧，段維勛，楊 陽，李 悅，梁振興，金振曉，易定華，俞世強

(1第四軍醫大學西京醫院，西安710032;2第四軍醫大學口腔醫學系)

藥物干預是對抗心肌缺血/再灌注損傷(IR)的重要策略和主要研究方向。但IR是由多種信號通路和細胞因子參與的復雜過程［1］，由于具體作用機制、藥物來源、副作用和倫理學等諸多問題，至今未能獲得理想的心肌保護藥物［2］。姜黃素(Curcumin，Cur)具有多重心血管保護作用，且毒性作用小、經濟、安全，是當前心肌IR研究領域極具研究價值和開發前景的中藥［3］。我們前期研究顯示，Cur后處理可有效對抗心肌IR損傷，但其機制尚未完全闡明［4］。2012年6～10月，我們觀察了 γ-分泌酶抑制劑DAPT(Notch信號通路特異性阻斷劑)對Cur后處理心肌保護作用的影響，探討Notch信號通路在Cur后處理在抗心肌IR中的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料 動物:成年SD大鼠40只，雄性，體質量220～250 g，由第四軍醫大學實驗動物中心提供。主要試劑和儀器:DAPT(Santa Cruz公司，美國)，2，3，5-氯三苯四唑(Sigma公司，美國)，LDH檢測試劑盒(南京建成公司，中國)。GAPDH小鼠抗大鼠多克隆抗體(中杉金橋生物技術有限公司，北京)，兔抗大鼠Notch1多克隆抗體(Abcom公司，美國)，辣根過氧化物酶標記羊抗兔或鼠IgG(中杉金橋生物技術有限公司，北京)，BCA-100蛋白質定量測定試劑盒(Pierce公司，美國)，組織裂解蛋白提取液(碧云天生物技術公司，上海)，蛋白酶抑制劑(Sigma公司，美國)，預染標準蛋白質Marker(Fermentas公司，美國)。Langendoff離體心肌灌注系統(Radnoti公司，美國)，MP100壓力換能器(Biopac Systems公司，美國)，電泳及濕轉轉移槽(Bio-Rad公司，美國)，Western發光照相系統(Bio-Rad公司，美國)。

1.2 實驗方法

1.2.1 離體心臟灌注模型建立及干預 根據文獻［4］，Langendoff系統采用經典的 KH 液灌裝，KH緩沖液成分(mmol/L):NaCl 118，KCl 4.7，CaCl21.25，MgSO41.2，KH2PO41.2，NaHCO325，葡萄糖5.5。灌流前50 min，以體積分數為95%的 O2和5%的CO2混合氣體向儲液罐內的灌流液中持續通氣，灌流液溫度維持在37℃，維持pH 7.35～7.45。SD大鼠腹腔注射戊巴比妥(30 mg/kg)和肝素(500 U/kg)后麻醉，迅速開胸取心臟，立即放入預冷的KH緩沖液(4℃)。將主動脈根部迅速固定于灌注管口，于37℃下用KH液逆行恒壓灌注(灌注壓為80 mmHg)。心臟復跳后，于左心耳處剪一小口，將帶有乳膠水囊的測壓管經二尖瓣插入左心室。連接壓力換能器，調節水囊使左心室舒張末壓至5～10 mmHg，心臟穩定灌注10 min、待心跳穩定后按分組進行灌注。

將40只SD大鼠隨機分為對照組、IR組、Cur組、Cur+DAPT組、DAPT組各8只。各組均采用離體心臟Langendoff逆行灌注10 min致心肌缺血，停止灌注30 min后除對照組外其余各組均予KH液再灌注150 min。Cur組再灌注液中含1 μM的Cur，Cur+DAPT 組含有 1 μM 的 Cur 和 0.5 μM 的DAPT，DAPT 組含有0.5 μM 的 DAPT。

1.2.2 觀察項目

1.2.2.1 血流動力學指標 采用MP100換能器記錄心臟缺血前10 min(以下稱為缺血前)及再灌注15、30、45 及 60 min(以下分別以 R15、R30、R45、R60表示)時的心率(HR)、左心室發展壓(LVDP)、左心室內壓最大變化速率(+dp/dtmax)。收集上述時間點的冠脈流出液，記錄冠脈流量(CF)。

1.2.2.2 心肌梗死面積(MI面積) 采用TTC染色法測定。參照文獻［4］，心臟處理完畢后于－70℃冷凍10 min，繼之沿心臟長軸切成橫切面1～2 mm的切片，每個心臟取直徑最長的一片。切片在TTC及0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液中孵育30 min(pH調整至7.4，溫度37℃)，再置于40 g/L的甲醛中固定過夜，并行數碼攝影。用linageJ1.37軟件行圖像分析，磚紅色區域為正常區域，灰白色區域為梗死區域。MI面積由總壞死區占總切片區的百分比表示。

1.2.2.3 冠脈流出液 LDH 水平 根據文獻［4］所述，留取各組R15時的冠脈流出液，LDH檢測試劑盒檢測流出液LDH水平，嚴格按照說明書操作。

1.2.2.4 心肌組織Notch1表達 采用Western blot法測定。將留取的心肌組織在裂解緩沖液中勻漿裂解，以12 000 r/min離心15 min。收集組織裂解物，BCA法測定蛋白濃度。取20 μg總蛋白于1×SDS緩沖液中煮7 min，進行SDS-PAGE電泳并電轉移至硝酸纖維素膜上。硝酸纖維素膜用含50 g/L脫脂奶粉的TBST室溫封閉1.5 h，依次滴加1∶1 000的抗Notch1及GAPDH抗體，4℃過夜后TBST洗滌3次，每次10 min。用1∶5 000的 HRP-羊抗兔或鼠IgG孵育2 h，再用TBST洗滌3次，每次10 min。最后用ECL發光液進行曝光顯影，Bio-Rad照相系統進行照相和并用其附帶的軟件分析蛋白的相對表達量。

1.3 統計學方法 采用SPSS 16.0統計軟件行統計學處理，實驗結果以ˉx±s表示。差異顯著性檢驗采用單因素方差分析，組間差異采用LSD-t法檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血流動力學指標 與IR組比較，DAPT組各時間點LVDP、+dp/dtmax均明顯降低(P＜0.01);與對照組比較，DAPT組加藥10 min內心率減慢，而LVDP、+dp/dtmax升高(P ＜0.01)，藥物去除后，LVDP和+dp/dtmax逐漸恢復到正常水平，各項指標與對照組比較差異無統計學意義。各組缺血前后相關指標比較見表1。

2.2 MI面積 各組MI面積比較見圖1。

2.3 冠脈流出液LDH水平 Cur組明顯低于IR組(P＜0.01);Cur+DAPT組明顯高于 Cur組(P＜0.01);DAPT組與IR組比較無統計學差異，見圖2。2.4 心肌組織Notch1蛋白表達 Cur組明顯高于IR組(P＜0.01);Cur+DAPT組明顯低于Cur組(P＜0.01);DAPT組明顯低于 IR 組(P ＜0.01)，見圖3。

表1 各組心臟血流動力學指標比較(n=8，ˉx±s)

3 討論

缺血性心臟病治療的核心是重新恢復心肌血液供應，但缺血心肌組織重新恢復血供(再灌注)后常繼發和加重心肌組織損傷，即心肌IR［1］，常導致患者死亡、預后不良、嚴重并發癥發生。心肌IR的病理機制復雜，很多信號通路和細胞因子參與其中［1，11～13］。

研究發現，Notch信號通路在心血管系統發生、發育、病理和生理過程中發揮重要作用［5］，可能在心肌梗死后心肌保護中發揮調控作用［6，7］;Cur可通過Notch信號通路抑制腫瘤細胞增殖并促進腫瘤細胞凋亡［8～10］。藥物后處理是對抗心肌IR的有效方法［14，15］。Cur是從 Cur科、Cur屬植物的根莖中提取的一種天然有效成分，分子式為C21H20O6，毒性作用小，安全范圍大［16］。Cur具有抗氧化、抗感染、抗炎、抗凝、降血脂、抗心力衰竭、抗心肌肥厚及抗動脈粥樣硬化等多種心血管效應，且毒性作用小、經濟、安全，尤其是其具有明確的抗IR、保護心肌作用極具研究價值和開發前景的中藥［17，18］。我們在前期研究中發現，Cur后處理可以有效拮抗心肌IR損傷，但具體機制尚未完全闡明。

圖1 各組MI面積比較

圖2 各組冠脈流出液中LDH水平比較

圖3 各組心肌組織Notch1蛋白表達比較

有報道，心梗后晚期Notch信號通路關鍵分子NICD(Notch-1分子胞內區)在心梗邊緣區(缺血但未壞死，可獲得有效再灌注)表達顯著上升，即Notch信號通路激活后心功能得到顯著改善，提示Notch信號通路激活可能在心肌IR修復中發揮重要調控作用，且與其它信號通路通過復雜的分子網絡產生交互作用［19］。本研究得到了相同結果;同時發現激活Notch通路有明確的抗心肌IR作用，其對于抗凋亡相關分子的轉錄和表達有重要調控作用［20～22］;提示Notch信號通路作為重要物質基礎參與了調控心肌的IR過程，激活Notch信號通路具有抗心肌IR作用。本研究發現，Notch通路在心肌急性IR過程中被抑制，而心梗晚期Notch通路活化參與損傷修復過程。進一步證實Notch信號通路可能在心肌梗死后的心肌保護中發揮調控作用［23］。研究顯示，Cur可通過Notch信號通路抑制食管腫瘤、口腔腫瘤和胰腺腫瘤細胞增殖并促進腫瘤細胞凋亡［8～10］;因此本實驗觀察了 DAPT對 Cur后處理心肌保護作用的影響。LDH廣泛存在于心肌細胞內，當細胞受損時，細胞內酶釋放到細胞外，使血清酶升高，故LDH水平可作為判斷心肌損傷程度的一項重要指標［12，19］。本研究結果顯示，Cur后處理可改善心臟血流動力學指標，減小MI面積，降低冠脈流出液中LDH釋放量。DAPT作為Notch信號通路的特異性阻斷劑可消除Cur后處理對心肌IR的保護作用，表現為心臟血流動力學減弱、MI面積增加、冠脈流出液中LDH釋放量增加。由此我們推測:Notch信號通路參與介導了Cur后處理抗心肌IR作用，其調控機制有待進一步研究。

本研究為Notch信號通路參與藥物后處理心肌保護作用提供了理論依據，有利于尋找全新的藥物作用靶點對心肌IR的主要作用環節進行干預，對于獲得全新的心肌保護方法提供了新的思路。

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