花粉壁發育相關基因的研究進展*

馬伯軍，劉程捷，陳析豐，程祝寬

(1.浙江師范大學化學與生命科學學院，浙江金華 321004;2.中國科學院遺傳與發育生物學研究所，北京 100101)

花粉壁作為植物細胞的一種防御結構，在花粉發育和受精過程中起著重要的作用［1］.花粉壁可維持花粉的空間結構及抵抗外界環境對花粉的傷害［2］;花粉的發育需要完整的花粉壁，否則會阻礙花粉的發育，導致花粉囊內花粉的降解［3］;花粉壁上的蛋白質還能與柱頭表面蛋白發生相互作用，參與花粉與柱頭之間的識別［4］.花粉壁是所有植物細胞壁和類型中最復雜的一種［5］.目前，比較一致的觀點是將花粉壁分為外壁和內壁:外壁主要由孢粉素構成，結構上又可分為外壁外層和外壁內層，其中外壁外層包含覆蓋層、柱狀層、含油層及基層;內壁由纖維素、果膠、構成疏水蛋白及水解酶等組成，其組分與植物的細胞壁相類似［5-6］.花粉壁的發育須經歷初生外壁的形成、外壁的形成及內壁的形成，并與花藥中一個至關重要的結構——絨氈層的發育密切相關［6］.絨氈層位于花粉囊壁最內層，從花粉母細胞形成時出現，在四分體時期細胞開始凋亡，最后在花粉成熟前完全消失［7］，它可向花藥室中分泌大量的碳水化合物、多種酶及脂類等物質，為小孢子發育提供所需的營養或構成花粉壁的重要成分［8-9］.

因此，花粉壁的形成和發育非常復雜，涉及大量營養物質的合成與運輸，其過程受一系列基因及信號轉導的調控.目前，關于花粉壁發育的遺傳與分子方面的研究已有許多報道.本文綜述了近年來對花粉壁發育相關基因的克隆及其功能研究的最新進展，初步探討了花粉壁發育的分子機理.

1 初生外壁形成的相關基因

花粉壁的發育從四分體時期開始，在減數第2次分裂結束后，小孢子細胞表面會形成一層由蛋白質、胼胝質及酸性多糖類等物質組成的致密纖維結構，這層特殊的結構被稱為初生外壁，隨著初生外壁的形成，小孢子花粉細胞膜也會形成褶皺結構［10］.目前，已在擬南芥(Arabidopsis thaliana)中發現了多個參與初生外壁形成的基因.擬南芥AtDEX1基因編碼一種植物特有的鈣結合蛋白，AtDEX1可與花粉表面的細胞膜連接，介導初生外壁外小孢子花粉表面的形成.在atdex1突變體中，花粉壁初生外壁與野生型相比變得較薄，無法觀察到表面的前柱狀層結構，且形成時期也變遲，導致孢粉素在花粉表面的沉積變得雜亂無章［11］.擬 南 芥 AtHKM 是 一 種 與 MS1(Male Sterile 1)同源的蛋白，作為轉錄調控因子，AtHKM是花粉壁發育過程中不可缺少的分子信號，調控著初生外壁的發育.athkm突變體的花粉壁初生外壁變薄，且一般不能包裹整個小孢子花粉，導致外壁結構的不規則［12］.擬南芥AtRPG1基因編碼一種細胞膜定位的MtN3家族蛋白，該蛋白可能與小孢子花粉細胞膜的褶皺結構的產生及細胞膜結構完整性的維持有關.atrpg1突變體由于初生外壁形成缺陷，孢粉素不能正常沉積，從而導致花粉壁形態結構的異常［13］.擬南芥AtNEF1蛋白是一種維持質體完整結構的相關蛋白，atnef1突變體的初生外壁也是不形成典型的外壁外層結構，但與atdex1，atrpg1及athkm1不一樣，atnef1突變體中孢粉素前體不沉積在不完整的初生外壁及花粉細胞膜上，而是以聚合物形式圍繞在小孢子周邊［14］.由此可見，AtNEF1的功能喪失導致了孢粉素前體沉積效應的完全消失.擬南芥AtTDE2基因編碼一種參與油菜素內酯合成的相關蛋白，attde2突變體的孢粉素前體剛開始并不沉積在花粉表面，而是隨機分布在花粉囊中，但隨著時間的推移，孢粉素最終還是能夠聚集到初生外壁上，形成正常的花粉壁及可育的花粉，說明油菜素甾醇類物質也直接或間接地參與了孢粉素前體在初生外壁上的沉積［15］.擬南芥 AtNPU基因編碼一類多糖類物質跨膜轉運蛋白，研究證明，AtNPU與初生外壁及小孢子花粉細胞膜表面褶皺結構的形成有關，其很有可能是與初生外壁多糖類物質的運輸相關.與atnef1類似，在atnpu突變體中，孢粉素前體也是以聚合物形式圍繞在小孢子周邊，而不沉積在花粉細胞表面［16］.

2 花粉壁外壁形成的相關基因

在四分體時期，隨著初生外壁的形成，絨氈層中合成的孢粉素前體開始沉積在小孢子花粉表面，這個過程將持續到囊泡期.到囊泡期，由于孢粉素的積累，在花粉表面形成了外壁的柱狀層、覆蓋層及基層結構;同時，在基層內層邊上會形成一層被鋨酸染色較深的纖維狀物質，即外壁內層結構［17］.

孢粉素的合成需經過多種調控因子及修飾酶的共同作用.絨氈層線粒體三羧酸循環(tricarboxylic acid cycle，TAC)產生的乙酰輔酶 A(acetyl-CoA)被運輸到質體，在酯酰輔酶A還原酶FAR(fatty acyl-CoA reductase，FAR)等酶的催化下形成十二碳月桂酸或進一步加工成長鏈脂肪酸(long-chain fatty acids，LCFA)或超長鏈脂肪酸(very long-chain fatty acids，VLCFA)，Vioque 等［18］曾證明其中FAR與扁豆(Pisum sativum L.)葉表面油脂類物質的形成有關，主要參與由乙酰輔酶A到脂肪酸鏈的形成過程.除FAR外，表面蠟質缺失蛋白(eceriferum，CER)也與植物體內超長鏈脂肪酸的形成相關.從Rice eFP Browser數據庫(http://www.bar.utoronto.ca/efprice/cgi-bin/efp-Web.cgi)中可以看到，OsCER1基因在水稻幼穗里的表達量極高，因此，OsCER1極有可能參與了孢粉素前體中超長鏈脂肪族衍生物的合成.擬南芥中AtCER1和AtCER3以復合體的形式參與脂肪酸鏈的合成過程，同時細胞色素CYTB5s以輔酶的形式參與該復合體功能的發揮［19］.擬南芥FLP1蛋白結構與CER家族蛋白有相似之處，擬南芥flp1不育突變體與CER家族不育突變體中花粉壁的表型很相似，擬南芥FLP1也很有可能參與超長鏈脂肪酸衍生物的生物合成過程［20］.擬南芥AtWDA1編碼一類內質網特異表達的脂肪酸去飽和酶，可以催化脂肪酸衍生物的脫羧反應，在atwda1突變體內可以觀察到絨氈層細胞質中有脂質體的積累，說明AtWDA1可能還與孢粉素前體的運輸相關［21］.

在孢粉素前體合成過程中，脂肪酸鏈的修飾需要在質體、內質網等多種細胞器中進行，而脂肪酸鏈在跨膜運輸前需要先經過加工，以脂肪酸-輔酶A的形式進行跨膜轉運，此修飾過程需要?；o酶A合成酶ACOS5(acyl-CoA synthetase 5)的參與［22］.細胞色素P450是一類參與許多生物合成途徑的氧化酶，在絨氈層細胞中，脂肪酸-輔酶A進入內質網后，需要在細胞色素 P450(cytochrome P450)家族蛋白的催化下被羥基化，其中:中鏈脂肪酸(medium-chain fatty acids，MCFA)由CYP703A2催化;C16和C18等長鏈脂肪酸則由CYP704B2負責羥基化;而超長鏈脂肪酸由何種酶修飾目前尚不清楚［7，23］.MS2 是一類脂肪酰-?；d體(fatty acyl-acyl carrier protein ACP reductase)還原酶，羥基化的脂肪酸被ACOS5酰基化后運送出內質網，再在MS2作用下去?；?，形成的脂肪醇則作為孢粉素前體成分［24］.同時，脂肪酰-?；d體復合物也可以在聚酮合酶(polyketide synthases)PKSA及PKSB作用下脫?；?，并催化形成孢粉素成分中的酚醛類物質及烷基吡喃酮等物質［25］.

孢粉素前體是在絨氈層中合成加工的，其最終將被運送到花粉表面成為花粉壁的主要組成成分.目前，對于孢粉素前體從絨氈層到小孢子表面的具體運輸方式的了解還不夠確切，但是在整個運輸過程中，需要一類跨膜運輸蛋白ABC轉運蛋白的參與［26］.ABC轉運蛋白廣泛存在于生物體內，它們結合并水解ATP(腺嘌呤核苷三磷酸)釋放能量，從而實現物質的跨膜運輸.已有的研究證明，ABC轉運蛋白 G家族的AtABCG26及OsABCG15分別參與擬南芥和水稻孢粉素前體的運輸，其功能的喪失將導致絨氈層內合成的孢粉素前體無法正常運送到小孢子花粉表面.在電鏡觀察下，atabcg26和osabcg15突變體絨氈層內有物質的異常積累，花粉表面呈光滑狀，花粉壁無正常的覆蓋層和柱狀層結構，由于花粉壁結構的缺陷，導致花粉發育無法正常進行，并最終影響植物的育性［27-31］.另外，AtABCG11參與擬南芥表面脂質物質的運輸，但在atabcg11功能缺失突變體中，植株花粉發育也出現異常，可能與孢粉素前體的運輸相關［32-33］.除ABC轉運蛋白以外，一類富含甘氨酸的蛋白GRP(glycine-rich protein)也與孢粉素前體的運輸相關.土豆中LeGRP92在四分體時期和小孢子花粉發育早期出現在初生外壁表面.LeGRP92蛋白的親水結構域與初生外壁表面結合，而疏水結構則可以結合孢粉素前體，從而介導孢粉素前體在出生外壁上的沉積.當LeGRP92表達水平降低時，雖然孢粉素仍可以在花粉表面沉積，但外壁的精細結構明顯發生了變化，最終導致植株的育性下降［34］.

孢粉素前體從合成到運輸過程中參與的蛋白及各種蛋白的功能可以大致概括如圖1所示:線粒體中經三羧酸循環產生的乙酰輔酶A在質體中經FAR等酶的催化形成中鏈脂肪酸，進而可以繼續進行碳鏈的加長，形成長鏈、超長鏈脂肪酸;脂肪酸經ACOS5酯化修飾后可能經WDA1等的運輸進入內質網;脂肪酸鏈在內質網中可以在WDA1，FLP1及CER家族蛋白的作用下再次加長;內質網中的脂肪酸的加工還包括由細胞色素類氧化酶進行羥基化形成脂肪醇，其中CYP704A2等酶負責中鏈脂肪酸的氧化，長鏈脂肪酸則由CYP704B2等羥基化，形成的脂肪醇復合物可以經MS2還原酶去?；纬芍敬?，此外還可以經聚酮合酶PKSA或PKSB加工成為酚醛類物質.孢粉素前體由絨氈層細胞內到花粉囊內小孢子細胞表面的運輸過程由多種蛋白介導，其中ABC轉運蛋白參與了孢粉素前體從絨氈層細胞內向花粉囊的分泌，而GRP蛋白參與結合花粉囊內游離的孢粉素前體，并引導其在初生外壁上的沉積(見圖1).但由于孢粉素前體從絨氈層到花粉囊再到花粉表面的運輸過程中涉及多種蛋白的參與，其具體機制還有待進一步的研究來證明.

圖1 絨氈層細胞中孢粉素前體的形成機制

3 花粉壁內壁形成的相關基因

花粉壁內壁的發育發生在外壁發育之后，其主要由纖維素、果膠及內壁蛋白所組成.近些年，對擬南芥和水稻中 atusp，atrgp1，atrgp2，atfla3，osrip1及osgt1等花粉壁內壁發育突變體的研究發現，在該類突變體中，花粉的外壁結構通常并無異常，且其突變表型發生在小孢子有絲分裂以后［35-39］.

AtUSP蛋白與核苷核糖的生物合成相關，其產物可以作為糖基轉移酶的底物，參與糖化物的生物合成［35］.AtRGP1和AtRGP2基因編碼一類轉運蛋白，它們可以結合細胞質中的核苷核糖，并將其運輸至內質網和高爾基體中以用于糖蛋白的合成.AtRGP1和 AtRGP2存在功能上的冗余，在atrgp1，atrgp2單突變體中，花粉壁內壁發育均無異常，只有在雙突變體中才會出現花粉壁的異常［36］.阿拉伯半乳聚糖是一類糖基化的細胞壁蛋白，它們是花粉壁內壁的主要成分之一，擬南芥一個相關基因FLA3(fascilin-like arabinogalactan ptotein 3)被RNAi抑制表達后，由于阿拉伯半乳聚糖的合成出現障礙，導致轉基因植株的內壁無法正常形成［37］.OsRIP1編碼一種含WD40重復序列的核定位蛋白，在osrip1突變體內，花粉粒中內壁變薄，且淀粉顆粒的合成也受到影響［38］.OsGT1是一種定位于高爾基體的核糖轉移酶，可能介導AtUSP類似蛋白產物的糖基轉移，與糖蛋白的合成相關，在花粉發育后期可以看到osgt1突變體中花粉外壁的結構完全正常，但無內壁的形成，且花粉粒中淀粉含量也下降，最終也導致花粉敗育［39］.雖然花粉壁內壁的具體功能目前還不清楚，但通過前人的研究結果，可以得知花粉壁內壁同樣與花粉的形成與發育密切相關.

4 小 結

花粉壁的發育是個復雜且意義重大的生物學過程.花粉壁發育過程中，初生外壁主要為孢粉素的沉積提供一個支撐結構，目前對初生外壁的研究還較少.擬南芥的研究表明，DEX1，NEF1，HKM，RPG1，TDE2及NPU等蛋白參與了初生外壁的形成，其中:HKM作為一種轉錄因子，調控著初生外壁的發育;而NPU則作為一種運輸蛋白，可能與初生外壁組分的運輸相關.相對而言，目前對于花粉壁外壁的研究較多，FAR，CER，WDA1，ACOS5，CYP703，CYP704，FLP1，MS2，PKSA，PKSB等酶參與了孢粉素前體合成過程中脂肪酸及脂肪酸衍生物的加工，其中WDA1可能還與脂肪酸族物質的運輸相關;另外，GRP蛋白及ABCG家族的AtABCG26，OsABCG15等參與了孢粉素前體從絨氈層到花粉表面的運輸過程.花粉壁內壁形成過程中涉及多種糖蛋白的代謝相關蛋白，包括 USP，RGP，FLA3，RIP1及 GT1 等，其中:USP 與核糖的形成相關，其產物可作為GT1等糖基轉移酶的底物;RGP蛋白負責聚集細胞質中的核糖，并將其運送到高爾基體中，以用于糖蛋白的合成;而FLA3則與內壁成分中阿拉伯半乳聚糖的合成相關.

由于花粉壁結構和組成成分較為復雜，且許多與花粉壁發育相關的基因還未被克隆，花粉壁形成過程中需要絨氈層細胞與花粉細胞之間大量的物質交流，其過程是怎樣調控的?物質運輸是怎樣介導的?以及花粉壁不同結構部分有怎樣的作用?等等.這些機制需要在細胞學、生物化學、分子生物學和遺傳學等方面進行更深一步的研究與探討.

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