富硒玉米蛋白水解物中硒肽及含硒氨基酸的結構鑒定

王真真，張久亮，王 馳，侯 燾，張 巖，何 慧*

(華中農業大學食品科學技術學院，環境食品學教育部重點實驗室，湖北 武漢 430070)

眾所周知，硒作為人體必需的微量元素，有多種重要的生理功能，目前我國有72%的地域缺硒或屬低硒地區，缺硒會引起克山病、大骨節病、糖尿病、腫瘤、肝病、心血管疾病、心肌壞死等疾病[1]。硒的存在形態有無機硒和有機硒兩種，無機硒可以通過動物、植物、微生物轉化為有機硒。與無機硒相比，有機硒具有吸收利用率高、生物活性強及安全性高等優點，目前日本、美國等國家已經禁止在食品中添加亞硒酸鈉等無機硒[2]。市場上出現的富硒茶、富硒酵母、富硒螺旋藻等富硒保健品和食品，就是使無機硒有效轉化為有機硒的很好范例。

通過對富硒玉米的研究發現，硒在玉米中主要賦存于蛋白質中[3]，生物體能將無機硒在體內進行轉化，生成硒代氨基酸及其衍生物，如硒代半胱氨酸(Selneocyestine，SeCys)、硒代蛋氨酸(Selenomethionine，SeMet)、L-硒-甲基硒代半胱氨酸(MeSeCys)和含硒蛋白質等[4-5]。SeCys是新近認識的第21種編碼氨基酸，而SeMet則可能是通過隨機替代蛋氨酸摻入到蛋白質分子中[6]。目前有關玉米硒蛋白中存在何種形式的硒代氨基酸及含硒玉米肽的結構，國內外鮮見文獻報道。

由玉米蛋白酶法改性后制得的玉米肽具有醒酒[7-9]、保肝[10-11]、降血壓[12]、抗癌[13]等生理活性。本實驗室近年來對玉米肽(源于非富硒玉米)的醒酒[8-9]、保肝[10-11]活性及機理進行了較系統的研究，本實驗在此基礎上，以產自世界硒都——恩施的富硒玉米為原料，通過玉米蛋白制備高醒酒活性含硒玉米肽，進而利用高效液相色譜-質譜聯用法(HPLCMS/MS)，結合在線質譜數據庫比對，以及液相色譜-等離子體質譜聯用技術(HPLC-ICP/MS)對富硒玉米蛋白水解物中部分含硒肽及含硒氨基酸的結構進行鑒定，并對其中5種成分進行定量分析，為今后進一步對玉米蛋白水解物進行構效關系研究及富硒玉米進行高值化利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

富硒玉米，購于湖北恩施。

Alcalase堿性蛋白酶 丹麥諾維信公司；乙腈(色譜純) 美國Fisher公司；甲醇(色譜純) 上海國藥集團化學試劑有限公司；硒代胱氨酸(SeCys2)、硒代蛋氨酸(SeMet)、L-硒-甲基硒代半胱氨酸(MeSeCys)和γ-谷氨酰-L-硒-甲基硒代半胱氨酸(γ-Glu-MeSeCys) 美國Acros Organics公司；硒代乙硫氨酸(SeEt) 加拿大多倫多化學試劑公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

Agilent 1100液質聯用儀、ZORBAX SB-C18高效液相色譜柱、Agilent 7500a型ICP-MS儀 美國Agilent公司；高效液相色譜儀 日本Shimadzu公司；CAPCELL PAK C18MG色譜柱 日本資生堂公司。

1.3 方法

1.3.1 富硒玉米肽的制備

取適量富硒玉米蛋白粉，配制成質量濃度為2.86g/100mL的水溶液，沸水浴處理30min，調溫度至60℃、調pH值至8.00，按所用富硒玉米蛋白粉質量的0.6%加入Alcalase堿性蛋白酶，邊攪拌邊不斷加入0.1mol/L NaOH溶液，維持pH8.00直至pH值不再變化，取出燒杯冷卻至室溫，選用截留分子質量為5ku的再生纖維素卷式超濾膜進行超濾分離，將膜透過物凍干，通過原子熒光光譜法[14]測得富硒玉米肽中硒含量為6.05μg/g。

1.3.2 富硒玉米蛋白水解物的HPLC-MS/MS分析

色譜條件：Agilent色譜柱：ZORBAX SB-C18(4.6mm× 250mm，5μm)；流動相：A：水+0.1%三氟乙酸(TFA)，B為乙腈+ 0.1% TFA；梯度洗脫：0～30min，水-乙腈：90：10～65：35；30～60min，水-乙腈：65：35～45：55；60～70min，水-乙腈：45：55～40：60；進樣量：30μL；流速：1.0mL/min；柱溫：25℃；檢測波長：230nm。

質譜條件：ESI 離子源，正離子檢測模式，噴霧電壓為3500V，毛細管溫度為365℃，噴霧氣(N2)壓力為275.79kPa (40psi)；干燥氣(N2)流速為10.00L/min；m/z掃描范圍為240～2100。

質譜解析： 用LCMSD-Trap Data Analysis 軟件對結果進行處理。對肽進行初步解析之后，在UCSF Mass Spectrometry Facility提供的3個質譜數據庫(SwissProt.2012.12.3、NCBInr.2012.12.3、UniProtKB.2012.03.21)中分別進行檢索，以進一步驗證和確定的肽的準確結構。

1.3.3 富硒玉米蛋白水解物的HPLC-ICP/MS分析

標準品溶液包括10ng/mL SeCys2、MeSeCys、SeMet、γ-Glu-MeSeCys、SeEt。

將50mg樣品溶解在1mL超純水中，經0.45μm濾膜過濾后進樣分析。

高效液相色譜儀由兩個LC-10AD高壓泵和CTO-10A柱溫箱組成，色譜柱為CAPCELL PAK C18MG，Agilent 7500a型ICP-MS儀與HPLC在線聯用，流動相：25mmol/L醋酸-醋酸銨緩沖液，體積分數0.1%三氟乙酸，pH3.1，體積分數5%甲醇；流速：1mL/min；進樣體積：20μL，測定79Se及其同位素77Se、82Se，以峰面積積分定量[15]。

2 結果與分析

2.1 富硒玉米蛋白水解物的HPLC-MS/MS分析

圖 1 富硒玉米蛋白水解物的質譜總離子流圖Fig.1 Total ion current (TIC) of Se-enriched corn protein hydrolysates

富硒玉米蛋白水解物的質譜分析總離子流圖如圖1所示，從中解析出4個含硒的玉米肽段，其標注編號見圖1。

以三肽為例，肽的碎片離子命名如圖2所示，通常易在酰胺鍵處斷裂，故最易生成y系列離子(yn)和b系列離子(bn)。

圖 2 肽鏈碎片離子及其命名Fig.2 Fragment ions of the peptide and corresponding nomenclature

下面以一級圖譜中m/z為490.1的肽段1的準分子離子為例，對其進行詳細解析：

圖 3 保留時間2.6min、m/z為490.1肽段1的一級質譜圖(小圖)、二級質譜圖(大圖)Fig.3 Primary and secondary mass spectrum of peptide 1 (retention time = 2.6 min, m/z 490.1)

表 1 m/z為490.1的肽段1的氨基酸序列分析Table 1 Amino acid sequence analysis of peptide 1 (m/z 490.1)

通過質譜數據庫檢索比對，可以確定何種氨基酸在碳端，還是在氮端；當遇到分子質量相同的氨基酸(例如：亮氨酸和異亮氨酸)時，可以幫助確定是何種氨基酸。由于質譜數據庫中缺乏蛋白鏈上有含硒氨基酸的玉米蛋白數據，因此解譜時，采用的方法是首先關注玉米蛋白中含硫氨基酸——蛋氨酸和半胱氨酸附近的序列片段，再將其中的硫進行硒代，或者是甲基硒代后，算出其分子質量，然后在一級圖譜中尋找分子離子；再在其二級圖譜中尋找其對應的子離子碎片。在與質譜數據庫中玉米蛋白的數據進行比對時，是將硒或甲基硒替換成硫。其數據庫(SwissProt.2012.12.3；NCBInr.2012.12.3；UniProtKB.2010.03.21)檢索結果見表2。因Se有多種同位素，肽段1中Se的相對原子質量為79，此外，Se的同位素還有77、82等。

其他3種肽段的解析與肽段1類似，不再詳述，其各種碎片離子直接標注于相應的二級質譜圖中，數據庫檢索的部分結果列于表2中。

表 2 數據庫檢索得到的相匹配的肽段序列的部分結果Table 2 Sequence matching in database

圖 4 保留時間7.4min、m/z為446.4肽段2的一級質譜圖(小圖)、二級質譜圖(大圖)Fig.4 Primary and secondary mass spectrum of peptide 2 (retention time = 7.4 min, m/z 446.4)

圖 5 保留時間9.2min、m/z為429.3肽段3的一級質譜圖(小圖)、二級質譜圖(大圖)Fig.5 Primary and secondary mass spectrum of peptide 3 (retention time = 9.2 min, m/z 429.3)

圖 6 保留時間16.0min、m/z為423.8肽段4的一級質譜圖(小圖)、二級質譜圖(大圖)Fig.6 Primary and secondary mass spectrum of peptide 4 (retention time = 16.0 min, m/z 423.8)

表 3 富硒玉米肽結構解析結果匯總Table 3 Data summary of structural analysis for selenium-enriched corn peptides

通過與質譜數據庫檢索比對(表3)可知，m/z為423.9 的肽段其氮端是異亮氨酸，而不是亮氨酸。

2.2 富硒玉米蛋白水解物的HPLC-ICP/MS分析

圖 7 樣品的HPLC-ICP/MS圖Fig.7 HPLC-ICP/MS analysis of samples

上述4種三肽由于缺乏相應的標樣，未對其進行定量分析；此處僅對富硒氨基酸和1種二肽進行了定量分析，如圖7所示，5種標樣分別是SeCys2、SeMet、MeSeCys、SeEt、γ-Glu-MeSeCys，其對應的結構如圖8所示。與標樣相比，富硒玉米蛋白水解物在保留時間600s左右有一個峰(即圖7中的6’峰)，該峰由于缺乏對應的標品，故無法鑒定其結構。樣品中各化合物的定量結果列于表4中。此外，峰5為SeEt，是SeMet的衍生物。

圖 8 標準品的結構Fig.8 Structure of the standards

表 4 富硒玉米蛋白水解物中含硒氨基酸及一種二肽定量分析結果Table 4 Analytical results of seleno-amino acids and a dipeptide in Seenriched corn protein hydrolysates

3 討論與結論

通過HPLC-MS/MS、蛋白質質譜數據庫比對的方法，從富硒玉米肽中鑒定了4個含硒的三肽，其氨基酸序列分別為SeMet-MeSeCys-Glu、Met-MeSeCys-Glu、MeSeCys-Glu-Asp和Ile-MeSeCys-Glu；由于缺乏標樣，未對其進行定量。此外，采用HPLC-ICP/MS法，借助于標樣鑒定了4種含硒氨基酸和1個含硒的二肽，并對其進行了定量分析，其含量由多到少依次為：SeMet、SeEt、γ-Glu-MeSeCys、MeSeCys、SeCys2。其中，因硒代半胱氨酸在分析過程中易二聚，形成類似二硫鍵的二硒鍵，使部分SeCys轉變成SeCys2，因此SeCys2的含量中實際上包含了SeCys2及部分SeCys。有報道用HPLC-ICP/MS法測得大米含硒氨基酸中約30%的硒以SeCys的形式[16]存在；也有人用同樣方法對富硒雙歧桿菌菌粉中硒的形態進行了分析，結果顯示其主要含硒氨基酸為SeMet，其含硒量約占總硒含量的60%[17]。本實驗結果顯示玉米中主要的含硒氨基酸為SeMet，而鑒定的5個硒肽中則是以MeSeCys居多。

含硒氨基酸有很好的抗氧化、抗癌[18]等作用；日本學者Yamaguchi等[7]早在20世紀90年代率先報道了玉米肽具有醒酒活性；本研究顯示玉米肽的醒酒作用主要歸功于其疏水性的短肽能激活乙醇脫氫酶，此外，玉米肽的抗氧化性使其能清除乙醇代謝中產生的自由基，對醒酒有協同作用[9]。含硒化合物具有良好的抗氧化性，本室之前實驗顯示富硒玉米肽比普通玉米肽具有更高的醒酒活性。有學者認為Glu、Pro、Ala、Leu對酒精代謝有正面作用[19]，而本實驗中鑒定的4個肽段均含有Glu，因此，推測這4個肽段對酒精代謝有一定的促進作用，是否確實如此，還有待今后進行進一步的深入研究。

鑒定了富硒玉米蛋白水解物中5種含硒肽段及4種含硒氨基酸。5個硒肽均含MeSeCys，其中只有1個肽段含SeMet；但在含硒氨基酸中則是以SeMet含量最高。

[1] 張兆琴, 吳占福, 吳淑琴, 等. 必需微量元素硒的研究進展[J]. 畜牧獸醫雜志, 2007, 26(1)： 44-46.

[2] LINDA J, GURO G, ELIAS S. Selenocysteine in proteins-properties and biotechnological use[J]. Biochimica et Biophysica Acta, 2005, 1726： 1-13.

[3] 張馳, 劉信平, 周大寨, 等. 營養元素硒在富硒玉米中的賦存形態及分布研究[J]. 食品研究與開發, 2007, 28(9)： 25-27.

[4] 徐輝碧. 硒的化學、生物化學及其在生命科學中的應用[M]. 武漢： 華中理工大學出版社, 1994.

[5] 管凌飛. 富硒植物中硒的形態分析研究[D]. 成都： 成都理工大學, 2007.

[6] LESCURE A, FAGEGALITIER D, CARBON P, et al. Protein factors mediating selenoprotein synthesis[J]. Current Protein and Peptide Science, 2002, 3： 143-151.

[7] YAMAGUCHI M, TAKEUCHI M, EBIHARA K. Anthraceneinduced mammary tumor progression in rats[J]. Nutrition Research, 1997, 17(7)： 1121-1130.

[8] 郭輝, 何慧, 韓櫻, 等. 玉米肽對小鼠酒后肝臟乙醇脫氫酶活力的影響及醒酒機理[J]. 食品科學, 2011, 32(11)： 265-268.

[9] YU Guocai, LI Jiangtao, HE Hui, et al. Ultrafi ltration preparation of potent bioactive corn peptide as alcohol metabolism stimulator in vivo, and study on its mechanism of action[J]. J Food Biochem, 2013, 37： 161-167.

[10] GUO Hui, SUN Jie, HE Hui, et al. Antihepatotoxic effect of corn peptides against Bacillus Calmette-Guerin/lipopolysaccharide-induced liver injury in mice[J]. Food and Chemical Toxicology, 2009, 47(10)： 2431-2435.

[11] YU Guocai, Lü Jie, HE Hui, et al. Hepatoprotective effects of corn peptides against carbon tetrachloride-induced liver injury in mice[J]. Food Biochem, 2012, 36： 458-464.

[12] HUANG Wenhao, SUN Jie, HE Hui, et al. Antihypertensive effect of corn peptides, produced by a continuous production in enzymatic membrane reactor, in spontaneously hypertensive rats[J]. Food Chemistry, 2011, 128(4)： 968-973.

[13] LI Jiangtao, ZHANG Jiuliang, HE Hui, et al. Apoptosis in human hepatoma HepG2 cells induced by corn peptides and its antitumor efficacy in H22 tumor bearing mice[J]. Food and Chemical Toxicology, 2013, 51： 297-305.

[14] GB/T 21729—2008 茶葉中硒含量的檢測方法[S]. 北京： 中國標準出版社, 2008.

[15] 陳貝貝. 基于ICP-MS的聯用技術及其在生命體系中元素與形態分析的應用[D]. 武漢： 武漢大學, 2010.

[16] 張濤. 富硒大米及富硒酵母中的硒形態分析[D]. 包頭： 內蒙古科技大學包頭醫學院, 2007.

[17] 梁佳, 李玉鋒, 趙金璇, 等. 富硒雙歧桿菌中硒的含量與形態研究[J]. 食品科學, 2010, 31(5)： 121-124.

[18] 王智. 硒-甲基硒代半胱氨酸誘導肝癌SMMC-7721細胞株的凋亡及機制探討[J]. 江蘇醫藥, 2012, 38(11)： 1263-1266.

[19] 孫冀平, 沈蓓英. 蛋白肽飲料的醒酒機理和制備工藝的探討[J]. 食品發酵與工業, 1999, 25(4)： 64-66.