天然抗氧化劑對貯藏過程中大豆分離蛋白的氧化及功能特性影響

郭鳳仙，黃小林，熊幼翎，陳 潔*

(江南大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122)

大豆分離蛋白(SPI)由于其優良的營養價值及功能特性被作為功能性添加劑廣泛應用于食品領域。但在貯藏及運輸過程中，SPI的品質會發生顯著的劣變，如其溶解度會大幅下降，從而影響最終食品品質的穩定性，這已經成為目前困擾SPI整個行業的難題。針對這一難題，國內外學者已經做了一定的研究。這些研究主要集中在影響SPI貯藏穩定性的環境因素上，如高溫高濕、高氧氣[1-3]及微量油脂的氧化[4]都被報道不利于蛋白的貯藏穩定性。但對于貯藏過程中SPI其他功能特性的變化，如乳化性、凝膠性，目前研究很少。同時，李祖胤等[4]的研究也表明在貯藏過程中SPI的氧化程度伴隨其溶解度的下降而升高。而吳偉[5]、黃友如[6]等研究表明微量的油脂氧化以及脂肪氧合酶的作用都可以導致大豆蛋白穩定性的下降。此外，還有研究表明在干燥前向SPI中添加抗氧化劑(BHA、TBHQ)能夠顯著提高蛋白的初始溶解度[7]。這說明SPI的貯藏穩定性的下降與蛋白氧化有一定關系。所以，本實驗主要探討SPI貯藏后的功能特性的變化，以及添加一些國標允許使用的天然抗氧化劑(β-胡蘿卜素和生育酚)對SPI的氧化及功能特性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

低溫脫脂大豆粕 秦皇島益海嘉里糧油食品有限公司。

生育酚、β-胡蘿卜素、5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、1-苯胺基-8-萘磺酸(ANS) 美國Sigma公司；金龍魚大豆油(食用級) 上海嘉里糧油工業有限公司；其他分析試劑均為分析純 上海國藥集團。

1.2 儀器與設備

TA-XT2i質構儀 英國Stable Micro Systems公司；T18 basic高速乳化均質機 英國IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 大豆分離蛋白的制備及貯藏

大豆分離蛋白的制備以低溫脫脂豆粕為原料，提取方法參考文獻[8]，使用堿溶酸沉的方法提取。酸沉后復溶到中性(pH 7.0)的SPI用去離子水稀釋到10g/100mL。分別將生育酚和β-胡蘿卜素(0.03g/100g pro，以干基計)用熱水(50℃)分散均勻，然后全部轉移到大豆蛋白溶液中，室溫下攪拌30min，過均質機，然后噴霧干燥。分別得到原始的空白SPI(NP)、添加β-胡蘿卜素的SPI(β-CT)以及添加生育酚的SPI(TOC)。微量凱式定氮測得的大豆蛋白產品純度為92.6%(m/m，以干基計)。將上述制備的4種SPI樣品真空塑封后在37℃條件下貯藏12周。

1.3.2 羰基含量

羰基含量的測定采用2,4-二硝基苯肼(DNPH)比色法[9]。將SPI粉溶解在去離子水中，室溫下攪拌1h，然后10000×g離心15min，取上清液用去離子水稀釋到1g/100mL，然后參考文獻[9]中的方法測定。

1.3.3 總巰基含量

總巰基的測定使用Ellman試劑法[10]測定。將SPI粉溶解在去離子水中，室溫下攪拌1h，然后10000×g離心15min，取上清液用去離子水稀釋到1g/100mL，然后參考文獻[10]中的方法測定。

1.3.4 溶解性測定

將固體SPI分散在去離子水中(2g/100mL)，室溫下攪拌1h使樣品溶解，靜置2min后，將上層液倒入離心管中10000×g離心15min。取上清液10mL，采用凱式定氮測定蛋白質含量。

1.3.5 乳化性測定

[11]的實驗方法， 配成蛋白濃度1g/100mL的溶液，取15mL蛋白溶液與5mL大豆油混合，放入100mL玻璃大試管中。在高速乳化均質機下13500r/min乳化2min，將乳化液迅速倒入25mL小燒杯中，立即開始取樣。取樣點固定在離燒杯底部0.5cm處，取20μL的乳狀液與5mL 0.1%的SDS溶液均勻混合，在波長500nm處測定其吸光度，記為A0，乳狀液靜置30min后采用相同的方法測定乳狀液吸光度，記為A30，用0.1%的SDS溶液做空白對照。

式中：T為系數，本實驗取2.303；N為稀釋倍數250；c為乳化液形成前蛋白質水溶液中蛋白質質量濃度/(g/mL)；φ為乳化液中油的體積分數(0.25)。

1.3.6 凝膠性測定

將12g/100mL的SPI水分散液在室溫下攪拌2h，使其均勻分散。將攪拌均勻的大豆蛋白分散液離心(1700r/min，5min)除去氣泡，然后轉移到50mL小燒杯中，保鮮膜封口，置于90℃恒溫水浴加熱30min，取出后冰浴冷卻。

凝膠強度的測定參考文獻[12]，略有改動。將制備好的凝膠在4℃冷室中過夜，取出后室溫下平衡30min，用質構儀測定其凝膠強度。主要參數為：探頭類型為P/0.5，測前速度1mm/s，測試速率1mm/s，測后速率10mm/s，穿刺距離4mm，觸發類型為自動，觸發力為5g。凝膠強度用硬度(hardness)，即探頭下壓過程中的最大感應力(單位g)表示。

1.3.7 數據分析

數據中的顯著性分析(P＜0.05)采用LSD測試(SPSS Statistical Software，美國)，顯著性分析中每個指標中的所有數據均為同組分析結果。

2 結果與分析

2.1 貯藏過程中不同添加劑對SPI氧化的影響

2.1.1 羰基含量

蛋白羰基的產生主要是在氧氣、油脂及金屬離子(Fe3+)的存在下，發生自由基傳遞反應，一般參與反應的有N末端的α-氨基、脯氨酸、精氨酸和賴氨酸側鏈以及半胱氨酸[13]。羰基含量是評價蛋白質的氧化程度的重要指標之一。因此本實驗通過測定蛋白在貯藏前后羰基含量的變化來研究不同的天然抗氧化劑對SPI氧化的抑制效果。如圖1所示，對照SPI (NP)在貯藏12周后，其羰基含量提高了80%，這說明SPI在貯藏過程中發生了顯著氧化，添加生育酚(TOC)對羰基的增加沒有顯著的抑制效果，而添加β-胡蘿卜素(β-CT)的SPI在貯藏12周后顯著抑制了羰基含量的上升，其羰基含量較對照組(NP)下降了34%。β-胡蘿卜素理論上能夠抑制由單線態氧引發的鏈式氧化反應，添加β-胡蘿卜素的SPI在12周貯藏過程中羰基水平幾乎沒有上升，而具有抑制自由基反應的生育酚對抑制SPI羰基含量的上升效應不夠顯著，暗示SPI在貯藏過程中羰基上升可能與單線態氧誘導的氧化反應有關。

圖 1 添加不同天然抗氧化劑的SPI貯藏12周羰基含量的變化Fig.1 Carbonyl group content changes of SPI samples with the addition of natural antioxidants during storage of 12 weeks

2.1.2 總巰基含量

圖 2 添加不同天然抗氧化劑的SPI貯藏12周總巰基含量的變化Fig.2 Total sulfhydryl group changes of SPI samples with the addition of natural antioxidants during storage of 12 weeks

如圖2所示，添加β-胡蘿卜素和生育酚的SPI 樣品在貯藏初期的巰基含量都要顯著高于對照組，特別是添加生育酚的SPI其初始巰基含量較對照組提高了20%。由于抗氧化劑均在噴霧干燥前添加，所以這一結果說明SPI中的巰基在噴霧干燥過程中存在氧化問題，抗氧化劑的添加一定程度上能夠抑制噴霧干燥引發的氧化。貯藏12周后， SPI樣品的巰基含量均顯著下降，添加兩種添加劑的SPI總巰基含量都顯著高于對照組。總巰基含量的下降可能的原因是在蛋白氧化過程中氧化成為二硫鍵或一系列酸性含硫酸基[13]。圖2結果說明，各類抗氧化劑對于SPI貯藏過程總巰基的變動也有一定抑制效應。

2.2 貯藏過程中不同添加劑對SPI功能特性的影響

2.2.1 溶解性

圖 3 添加不同天然抗氧化劑的SPI貯藏12周溶解度的變化Fig.3 Solubility changes of SPI samples with the addition of natural antioxidants during storage of 12 weeks

良好的溶解性是蛋白質發揮其他功能特性的前提。添加不同抗氧化劑對SPI貯藏前后溶解度的影響如圖3所示。總體而言，添加抗氧化劑對于SPI的初始溶解度影響不顯著，而貯藏12周后，添加β-胡蘿卜素和生育酚的SPI溶解度顯著高于對照組樣品。

2.2.2 乳化性

圖 4 添加不同天然抗氧化劑的SPI貯藏12周乳化性和乳化穩定性的變化Fig.4 Changes in emulsifying activity (A) and emulsion stability (B) of SPI samples with the addition of natural antioxidants during storage of 12 weeks

不同SPI乳化性在貯藏12周前后的變化如圖4所示。添加不同抗氧化劑的SPI初始乳化性與對照相比(圖4A)均略有下降。而貯藏12周后，各SPI樣品的乳化性都有顯著下降，但添加β-胡蘿卜素和生育酚的SPI乳化性下降幅度顯著小于對照組。相比乳化性，抗氧化劑的添加對乳化穩定性(圖4B)的影響非常劇烈。抗氧化劑的各SPI其初始乳化穩定性與對照相比都顯著降低。在貯藏12周后，對照SPI的乳化穩定性下降了一半以上，而添加β-胡蘿卜素的SPI乳化穩定性反而分別比貯藏初期上升了49%和69%。從羰基(圖1)及巰基(圖2)測定結果推測，在溶解度(圖3)差別不大的條件下，乳化穩定性的改善與羰基值關聯度較小，但與總巰基的變動趨勢很接近，說明二硫鍵大量被還原是不利于乳化穩定性的，而巰基的輕度氧化交聯有可能有利于乳化穩定性，但巰基的重度氧化交聯可能不利于乳化穩定性。有研究表明[14]肌肉蛋白的氧化對蛋白乳化穩定性有損傷作用。

2.2.3 凝膠強度

添加不同抗氧化劑的SPI對其凝膠強度有輕微的破壞作用。如圖5所示，在貯藏初期，添加抗氧化劑的SPI凝膠強度均低于對照組，特別是添加β-胡蘿卜素的SPI凝膠強度較對照下降了26%。但在貯藏12周后，雖然蛋白的溶解度都有不同程度的顯著下降，但各組SPI的凝膠強度均較貯藏前有大幅度升高，其中對照組升高幅度最大。這可能與SPI在貯藏過程中發生氧化有關，巰基交聯或者羰基升高暗示的氧化交聯可能有助于SPI凝膠強度的提高。有研究表明大豆蛋白和肌原纖維蛋白經輕微氧化后其凝膠強度得到提高[14-15]。但各SPI的氧化程度與凝膠強度對應性不強，這說明除了氧化以外，SPI貯藏后凝膠強度升高可能還有其他影響因素。

圖 5 添加不同天然抗氧化劑的SPI貯藏12周凝膠強度的變化Fig.5 Gel strength changes of SPI samples with the addition of natural antioxidants during storage of 12 weeks

3 結 論

未添加抗氧化劑的SPI經12周貯藏后蛋白氧化顯著，羰基含量顯著升高和總巰基含量顯著下降，同時，其溶解性及乳化活性都大大降低，但凝膠強度卻顯著上升(P＜0.05)。天然抗氧化劑β-胡蘿卜素和生育酚的添加都顯著抑制了長期貯藏造成的SPI中蛋白質的氧化(羰基含量的上升和巰基含量的下降)、SPI的溶解性及乳化性的下降(P＜0.05)，同時也部分抑制了貯藏后SPI凝膠強度的提高。

參考文獻：

[1] MARTINS V B, NETTO F M. Physicochemical and functional properties of soy protein isolate as a function of water activity and storage[J]. Food Research International, 2006, 39(2)： 145-153.

[2] 石彥國, 劉洪洪, 孫冰玉. 儲藏條件對大豆分離蛋白溶解性的影響[J]. 食品工業科技, 2010(3)： 336-338.

[3] 孫冰玉, 石彥國, 宿晨, 等. 高溫高濕對大豆分離蛋白組分及乳化性的影響[J]. 食品工業科技, 2011(3)： 159-162; 165.

[4] 李祖胤, 曾茂茂, 何志勇, 等. 長期貯藏大豆分離蛋白溶解性下降原因探討：大豆分離蛋白中微量油脂氧化的影響[J]. 食品與發酵工業, 2012, 38(6)： 12-16.

[5] 吳偉, 林親錄, 華欲飛. 亞油酸氫過氧化物氧化修飾對大豆蛋白熱變性和聚集的影響[J]. 中國油脂, 2011, 36(5)： 16-20.

[6] 黃友如, 華欲飛, 王雪峰, 等. 脂肪氧合酶催化亞油酸氧化與大豆蛋白相互作用過程中自由基遷移的電子順磁共振研究(Ⅱ)自由基類型的確定[J]. 食品科學, 2008, 29(4)： 41-45.

[7] BOATRIGHT W, HETTIARACHCHY N. Soy protein isolate solubility and surface hydrophobicity as affected by antioxidants[J]. Journal of Food Science, 1995, 60(4)： 798-801.

[8] FENG Jianlin, XIONG YoulingL.. Interaction of myofibrillar and preheated soy proteins[J]. Journal of Food Science, 2006, 67(8)： 2851-2856.

[9] LEVINE R L, GARLAND D, OLIVER C N, et al. Determination of carbonyl content in oxidatively modified proteins[J]. Methods in Enzymology, 1990, 186： 464-478.

[10] HOSHI Y, YAMAUCHI F. Determination of sulfhydryl and disulfi de contents of soybean 11S globulin and their change by lyophilization[J]. Agricultural and Biological Chemistry, 1983, 47(11)： 2435-2440.

[11] MOLINA E, PAPADOPOULOU A, LEDWARD D. Emulsifying properties of high pressure treated soy protein isolate and 7S and 11S globulins[J]. Food Hydrocolloids, 2001, 15(3)： 263-269.

[12] 王嬋秋, 遲玉杰. 乙醇、氯化鈣和抗壞血酸對SPI凝膠性質的影響[J]. 中國糧油學報, 2010, 25(7)： 39-42.

[13] BARELLI S, CANELLINI G, THADIKKARAN L, et al. Oxidation of proteins： basic principles and perspectives for blood proteomics[J]. Proteomics Clinical Applications, 2008, 2(2)： 142-157.

[14] SRINIVASAN S, HULTIN H O. Chemical, physical, and functional properties of cod proteins modified by a nonenzymic free-radicalgenerating system[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1997, 45(2)： 310-320.

[15] LIU Gang, XIONG YoulingL., BUTTERFIELD D. Chemical, physical, and gel-forming properties of oxidized myofi brils and wheyand soy-protein isolates[J]. Journal of Food Science, 2006, 65(5)： 811-818.