不同品種花生蛋白主要組分及其亞基相對含量分析

杜 寅，王 強*，劉紅芝，王 麗，劉 麗

(中國農業科學院農產品加工研究所，農業部農產品加工綜合性重點實驗室，北京 100193)

花生中蛋白質含量為24%～36%，根據花生蛋白的溶解特性，將其分為兩大類即水溶性蛋白和鹽溶性蛋白，其中大約10%的蛋白質是水溶性蛋白，稱之為清蛋白，其余的90%為鹽溶性蛋白[1]。鹽溶性花生蛋白主要包括花生球蛋白(14S，類似于11S大豆球蛋白)、伴花生球蛋白Ⅱ(7.8S，類似于7S豌豆球蛋白)和伴花生球蛋白Ⅰ(2S)[2-3]。伴花生球蛋白Ⅰ和伴花生球蛋白Ⅱ亞基組成基本相同，而花生球蛋白亞基組成存在差異。Krishna等[4]報道不同基因型花生的球蛋白存在4種亞基模式，第1類含有47.5、45.1、42.6、21.4kD 4個亞基，第2類含有47.5、45.1、41.2、21.4kD 4個亞基，第3類含有47.5、45.1、42.6、41.2、21.4kD 5個亞基，第4類含有47.5、45.1、21.4kD 3個亞基。黎茵等[2]研究表明，花生種子蛋白組成的主要差異在于花生球蛋白亞基組成的不同，分為4類，第1類含有41、38.5、18kD，第2類含有41、38.5、37.5、18kD，第3類含有41、38.5、36.5、18kD，第4類主要含有41、38.5、37.5、36.5、18kD。

本課題組前期研究結果表明，花生球蛋白與伴花生球蛋白含量與花生蛋白質功能性質密切相關，花生球蛋白含量越高，蛋白質溶解性越好，伴花生球蛋白含量越高，凝膠性越好。同時研究結果表明蛋白質亞基含量與花生蛋白質的凝膠性和溶解性密切相關。本實驗采用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進行蛋白質分析測定。通過對170份不同品種花生蛋白亞基含量的測定分析，旨在探索花生種質資源中蛋白質組成、亞基組成及其含量變化情況，對于花生蛋白品質遺傳育種改良以及花生蛋白的開發利用潛力巨大；為篩選某一蛋白質組分含量高及具有好的凝膠性、溶解性等功能性質的優質花生品種提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

表 1 供試花生品種編號Table 1 List of peanut cultivars tested in this study

從全國花生主要種植區收集花生品種(系)170份，收獲年份為2010年。其中包括山東、河南、廣東、江蘇、福建、廣西、河北、吉林等主要花生種植省份，樣品需低溫保藏，花生品種編號見表1。

十二烷基硫酸鈉(SDS)、丙烯酰胺(acrylamide)、低分子質量標準蛋白質、考馬斯亮藍R250、尿素 美國Sigma公司；四甲基乙二胺(TEMED)、N,N’-甲叉雙丙烯酰胺(Bis-acrylamide) 德國Merck公司；過硫酸銨(AP) 中國醫藥集團(上海)化學試劑公司；三羥基甲基氨基甲烷(Tris) 美國Angus公司；溴酚藍(bromophenol blue，BPB) 國藥集團化學試劑有限公司；β-巰基乙醇(β-ME) 美國Amresco公司；甘氨酸(Gly) 北京索來寶生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

垂直板電泳槽(儀) 美國Bio-Rad公司；AlphaEase FC凝膠成像系統 美國Alpha Innotech 公司。

1.3 方法

1.3.1 花生蛋白樣品的制備

采用堿溶酸沉工藝提取蛋白[5]，冷凍干燥備用。

1.3.2 樣品溶液的制備將0.1g的蛋白樣品溶解于20mL 0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH7.2)中，漩渦振蕩10min使其充分溶解，10000r/min高速離心10min，吸取10μL上清液，添加10μL樣品緩沖液，混勻，上樣前沸水浴5min，冷卻后即為上樣溶液用于后續電泳實驗。

1.3.3 SDS-PAGE電泳

參考王延華[6]、Laemmli[7]等方法。

1.4 數據分析

蛋白質電泳圖譜采用AlphaEase FC凝膠成像系統進行拍照，并用其自帶的AlphaEase FC分析軟件進行分析。各亞基的相對含量定義為其光密度占該泳道總光密度的百分比。數據分析采用Microsoft Offi ce Excel 2007、SAS和SPSS 12.0.1軟件。

2 結果與分析

2.1 不同品種花生蛋白主要組分相對含量的差異分析

表 2 花生蛋白組分相對含量變異性分析Table 2 Variation in the relative content of protein fractions among different peanut cultivars

由表2可知，170個花生品種伴花生球蛋白Ⅰ和伴花生球蛋白Ⅱ含量的變異系數較大，分別為11.59%和13.02%，說明各品種間二者差異較大。由表3可知，花生球蛋白與伴花生球蛋白比值變化范圍介于0.80～1.68之間，平均值為1.24±0.19，比值高于平均值的有85個品種，占實驗樣品數量的一半。170個花生品種的花生球蛋白與伴花生球蛋白比值的變異系數為15.23%，超過了10%，說明不同花生品種之間蛋白質組成存在較大的遺傳變異性。由圖1和表3可知，花生球蛋白與伴花生球蛋白比值主要分布于1.2～1.4之間，比值最高的達到1.68，是江蘇的花生品種徐花5號，比值最低的為0.80，是山東花生品種魯花8號。研究表明，大豆11S、7S及11S/7S與功能性質密切相關，11S比7S二硫鍵含量高，并且結構緊密，因此，形成的凝膠性硬度比7S大，但7S組分的乳化能力和溶解度都要高于11S組分[8]，Saio[9]報道了11S球蛋白制成的豆腐凝膠硬度、彈性及黏性都明顯好于7S球蛋白制成的豆腐。Arrese等[10]研究表明，大豆蛋白的11S/7S比值與蛋白質的熱凝膠關系密切。11S/7S與豆腐凝膠硬度呈顯著正相關(r=0.86)[11-12]。而不同花生品種之間花生球蛋白與伴花生球蛋白比值差異較大，為篩選具有優質功能性質(如凝膠性、溶解性、乳化性等)的花生品種提供一定依據。

表 3 花生球蛋白與伴花生球蛋白比值分布情況Table 3 Distribution of arachin/conarachin ratio

圖 1 花生球蛋白與伴花生球蛋白比值分布圖Fig.1 Graphic representation of the distribution of arachin/conarachin ratio

2.2 不同品種花生蛋白質亞基相對含量的差異分析

由圖2可知，通過SDS-PAGE電泳將170個花生品種的花生蛋白分離成8個明顯的條帶。包括有花生球蛋白的共4個條帶，分子質量分別為40.5、37.5、35.5、23.5kD；伴花生球蛋白Ⅱ有1個條帶，分子質量為61kD；伴花生球蛋白Ⅰ有3個條帶，分子質量分別為15.5、17、18kD。雙紀2號、粵油14號、閩花9號等35個品種的35.5kD亞基出現了缺失，占所測試品種的20.59%。國外，Shokarii等[13]已報道花生的某些品種花生球蛋白缺少36.5kD亞基，Krishna等[4]則報道除此外還有某些品種的花生球蛋白同時含有36.5kD和37.5kD亞基，或者不含37.5kD亞基。由于不同實驗條件的誤差，可認為與35.5kD亞基為同一個亞基，可與本實驗結果相印證。研究表明，植物蛋白在加工時的工藝性質如溶解性、起泡性、凝膠性、熱凝聚性、乳化性與植物蛋白的分子質量分布、亞基的大小/組成、亞基的解離/聚合性質、二硫鍵多寡及其熱穩定性、親水/疏水性有密切的關系[14]。因此，通過培育不同亞基組成的花生品種，有助于改良花生蛋白質的品質及功能特性。條帶的粗細、染色的深淺度有較大差異，表明各個亞基的含量具有顯著變化。

圖 2 部分花生蛋白亞基組成SDS-PAGE電泳圖譜Fig.2 SDS-PAGE profi le of peanut protein and subunit composition of partial cultivars

表 4 花生蛋白亞基相對含量變異性分析Table 4 Variation in the relative content of protein subunits among different peanut cultivars

由表4可知，花生球蛋白中變異系數最大的是35.5kD亞基，變異系數達55.07%，具有明顯的品種間差異性；37.5kD亞基相對含量次之，變異系數為19.17%，最小的是23.5kD亞基，變異系數為7.27%。而伴花生球蛋白中15.5kD亞基變異最大，變異系數為22.09%，其余各亞基含量的變異系數均大于10%，存在顯著差異。花生球蛋白中23.5kD亞基含量遠高于其他各個亞基，相對含量為(22.75±1.65)%；而伴花生球蛋白中61kD亞基含量遠高于其他各個亞基，相對含量達到(19.21±2.50)%。

Utsumi等[15-16]通過研究發現，大豆蛋白質凝膠形成中11S蛋白質中的酸性亞基As-Ⅲ比As-Ⅳ更加重要，而7S蛋白質中的3個亞基均參與了凝膠的形成，在SPI的凝膠中7S球蛋白的β亞基與11S球蛋白的堿性亞基有選擇地交互作用，并直接影響著SPI的凝膠性，11S蛋白質的酸性亞基對凝膠網絡狀結構的形成具有重要作用。Tay[17]、程翠林[12]等研究結果表明，亞基α’、α、β與乳化性呈正相關，亞基A1,2,4及亞基β則與乳化性呈負相關。劉春等[18]分析4個蛋白亞基變異類型大豆品種制備的SPI，結果表明11S組分單個亞基缺少對大豆蛋白的溶解性、乳化性、乳化穩定性和熱穩定性影響不顯著，11S組分含量顯著降低或缺失能提高大豆蛋白的乳化性和乳化穩定性。Salleh等[19]研究了7S球蛋白缺失α及α’亞基對大豆蛋白凝膠的影響。在相同條件下，組分對凝膠硬度的影響關系是缺失α’亞基＞7S全亞基＞缺失α亞基。以分子遺傳學為基礎結合食品科學研究大豆蛋白亞基對其功能性的影響，培育出特異11S和7S蛋白組分含量及亞基種質的食品專用大豆品種是研究蛋白質亞基的一個很好的切入點。20世紀90年代后，在大豆蛋白亞基構成及其加工特性的研究中，通過某種方法改變大豆蛋白質的亞基構成獲得缺失某亞基的大豆品種，使之成為適宜加工需求特性的專用大豆原料已越來越受到研究者的重視。而對花生蛋白質亞基缺失對功能性的影響未見報道，因此花生蛋白各組分亞基的缺失對其功能性的影響將是一個很好的研究方向。

表 5 170份花生品種的蛋白組分及其亞基相對含量的相關性分析Table 5 Correlation analysis of the relative content of peanut protein fractions and subunits among 170 cultivars

2.3 不同品種花生蛋白組分及其亞基相對含量的相關性分析

經SPSS 12.0.1對花生蛋白組分及其亞基相對含量進行相關性分析，由表5可知，花生球蛋白、伴花生球蛋白及其比值間、各組分與其構成亞基間以及各個亞基相互之間基本都存在相關性。花生球蛋白與伴花生球蛋白之間(－0.998**)在0.01水平上呈現極顯著負相關關系，兩者相互制約，此消彼長。花生球蛋白與伴花生球蛋白各個亞基，如18kD亞基(－0.640**)、17kD亞基(－0.482**)、15.5kD亞基(－0.528**)、61kD亞基(－0.641**)均在0.01顯著水平上達到極顯著負相關，說明花生球蛋白含量越高，伴花生球蛋白各亞基含量越低。此外，花生球蛋白組分與35.5kD亞基(0.788**)為極顯著正相關，相反，伴花生球蛋白組分與35.5kD亞基(－0.791**)呈現極顯著負相關；花生球蛋白和伴花生球蛋白比值與35.5kD亞基(0.764**)呈極顯著正相關。相關性分析表明花生蛋白各主要組分及其亞基之間相互影響，若改變其中任意一種成分的含量，都有可能直接或間接的影響到其他成分的含量。因此，可以通過增大35.5kD亞基的含量來提高花生球蛋白組分的含量，從而提高花生球蛋白和伴花生球蛋白比值；同時也可以增加伴花生球蛋白的含量及相應亞基的含量，為選育高花生球蛋白或高伴花生球蛋白含量并具有好的溶解性、凝膠性等功能性質的花生品種提供一定的理論參考。

3 結 論

3.1 170種花生品種的花生球蛋白、伴花生球蛋白和花生球蛋白與伴花生球蛋白比值的變異非常廣泛，變異系數大都在10%以上。表明我國花生球蛋白、花生球蛋白與伴花生球蛋白組分含量變異種質資源非常豐富，花生蛋白品質遺傳育種改良以及花生蛋白的開發利用方面的潛力巨大；為篩選某一花生蛋白組分含量高及具有好的凝膠性、溶解性等功能性質的花生品種提供一定的理論依據。

3.2 不同花生品種的蛋白亞基相對含量在種質材料間存在差異，其中，花生球蛋白的35.5kD亞基差異最顯著，變異系數達55.07%，雙紀2號等35個品種缺失35.5kD亞基條帶，占所分析測試品種的20.59%。

3.3 花生蛋白主要組分花生球蛋白、伴花生球蛋白及其比值間、各組分與其構成亞基之間以及各個亞基相互之間基本上都存在相關性。花生球蛋白與伴花生球蛋白之間呈極顯著負相關。

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