核桃蛋白源血管緊張素轉化酶抑制劑的分離純化

顧 欣，李 迪，侯雅坤，崔 潔，王建中,*

(1.北京林業大學生物科學與技術學院，北京 100083；2.林業食品加工與安全北京市重點實驗室，北京 100083；3.河北化工醫藥職業技術學院，河北 石家莊 050026)

血管緊張素轉化酶(angiotensin Ⅰ-converting enzyme，ACE)是腎素血管緊張素系統中的關鍵酶，它能催化血管緊張素Ⅰ轉化成促血管收縮的血管緊張素Ⅱ，并且能使促進血管擴張的緩激肽失活[1]。ACE抑制劑的來源很多，最早的天然ACE抑制劑是從蛇毒液中發現的[2]。目前，食物源蛋白源的ACE抑制劑大致可以分為3類：動物來源、發酵食品來源和植物來源。動物蛋白源的ACE抑制劑主要由水產品蛋白和畜禽肌肉蛋白水解得到，如從沙丁魚[3]、金槍魚[4]、中國毛蝦[5]、鰹魚[6]、豬骨骼肌[7]水解物中都發現了具有新的氨基酸序列的ACE抑制肽。發酵食品來源的ACE抑制劑主要是通過乳酸菌發酵得到。Nakamura等[8]研究了發酵產品中發酵乳的抗高血壓效應，該發酵乳是由常用的16種乳酸菌發酵制備而成。Nielsen等[9]發現來自于多種乳酸菌的蛋白酶水解乳蛋白也可釋放出ACE抑制肽，這些乳酸菌大部分用于發酵乳制品的生產。Saito等[10]從清酒和酒糟中分離出9種ACE抑制肽，并通過實驗探索了肽的結構特點。植物蛋白源來源廣泛，價格低廉，因此成為制備ACE抑制肽的較好選擇。早在1991年，Miyoshi等[11]就從天然α-玉米蛋白嗜熱菌蛋白酶水解物中分離出ACE抑制作用的短肽。植物蛋白源ACE抑制劑以豆類為來源的研究較多。以大豆多肽為例，張國勝等[12]以大豆分離蛋白為原料，選用4種蛋白酶對大豆蛋白進行水解并比較水解產物對ACE的抑制效果，最終得到IC50值為0.846mg/mL的水解液。Shin等[13]從豆漿中分離一種三肽，并將該三肽連續注射SHR鼠，在多次注射后SHR鼠血壓明顯降低。許慧嬌等[14]僅研究出核桃蛋白酶解物有一定的抑制ACE作用并未行進進一步的分離純化。中國是核桃生產最大的國家，核桃制油后廢棄了大量的核桃渣，采用核桃渣為原料開發核桃蛋白肽，原料非常豐富，價格低廉。本研究希望能利用核桃粕，分離純化核桃蛋白水解物中的多肽，并通過體外測定ACE抑制活性的方法篩選，最終期望得到高活性的ACE抑制劑。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

核桃粕由河北晶果果業有限責任公司提供。

胃蛋白酶、馬尿酰組氨酰亮氨酸(Hip-His-Leu，HLL)、血管緊張素轉化酶(ACE)、Sephadex G-25葡聚糖凝膠 美國Sigma公司；乙腈、三氟乙酸、氫氧化鈉、鹽酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉等均為國產分析純。

CXG-1電腦層析柜 上海滬西分析儀器廠有限公司；Sephadex G-25 Medium柱(1.6cm×60cm) 美國Pharmacia公司；PPSQ-31A全自動蛋白/多肽序列儀 日本Shimadzu公司。

1.2 核桃蛋白的制備[15]

室溫下將核桃粕粉用石油醚浸泡脫脂，反復幾次至脫油徹底，置于通風處晾干，過80目篩，得到脫脂核桃粉，真空包裝，于4℃條件下保存。

稱取一定質量的脫脂核桃粕粉，加入適量去離子水，脫脂核桃粕粉與水液料比為12：1(V/m)，超聲細胞破碎處理30min。樣品溶液保持反應體系溫度為65℃，用1mol/L NaOH溶液調至pH9.0，提取4h后，終止反應，4000r/min離心20min，取上清液，用1mol/L HCl調節至等電點(PI)4.5進行酸沉，靜置一段時間后，5000r/min離心15min，取沉淀，用去離子水洗沉淀至中性，迅速真空冷凍干燥，于－20℃保存。

1.3 核桃蛋白水解物的制備[16]

用胃蛋白酶對核桃蛋白進行水解，水解條件為：將10g核桃蛋白粉溶于200mL去離子水中，配制成液料比為20：1(V/m)，用1mol/L HCl調至最適pH 3.0，加酶量為0.04g/g樣品，并維持反應體系溫度55℃，水解時間4h。水解之后，樣品置于90℃水浴中滅酶30min。滅酶后將樣品離心(5000r/min、20min，4℃)，上清液調至pH7.0，冷凍干燥后于－20℃保存。

1.4 核桃蛋白水解物的分離純化

1.4.1 超濾

胃蛋白酶水解物在4℃條件下經不同分子質量大小的超濾膜(截留分子質量：10000、5000D)獲得具有不同分子質量的濾液，得到分子質量大小范圍為0～5kD、5～10kD的濾液。將不同分子質量范圍的濾液迅速真空冷凍干燥，并置于－20℃保存。

1.4.2 Sephadex G-25柱層析

具有高ACE抑制活性的凍干粉溶解在5mL 10mmol/L Tris-HCl(pH7.0，內含150mmol/L NaCl)中，并經脫氣及0.22μm膜過濾處理，然后經CXG-1電腦層析柜進行層析純化。流動相為：10mmol/L Tris-HCl(pH7.0，內含150mmol/L NaCl)。色譜柱條件：Sephadex G-25 Medium柱(1.6cm×60cm)，流速為1mL/min，整個設備系統在4℃條件下進行。洗脫峰在280nm波長處進行檢測并收集，其活性最高的組分收集液迅速進行真空冷凍干燥，并置于－20℃保存。

1.4.3 SuperdexTMPeptide 10/300 GL柱分離

凝膠過濾分離：高ACE抑制活性的凍干粉用20mmol/L PBS(pH7.0)緩沖液溶解到1mL，并經0.22μm微孔濾膜及脫氣處理，然后經AKTA系統凝膠過濾純化。

流動相為：20mmol/L PBS(pH7.0)。色譜柱條件：SuperdexTMPeptide 10/300 GL柱(10mm×300mm)，流速為0.5mL/min。洗脫峰在280nm波長處進行檢測并收集，其ACE抑制活性最高的組分收集液迅速進行冷凍干燥，并置于－20℃保存。

1.4.4 反相高效液相色譜(RP-HPLC)純化

將最高活性組分收集液的凍干粉，溶解于流動相流動相A(V(三氟乙酸)：V(水)為0.6：1)中，并經脫氣過膜處理，然后經反相高效液相色譜柱進一步分離純化。色譜柱條件：Zorbax SB-C18柱(4.6mm×250mm)，流速為1.0mL/min。色譜柱先用流動相A平衡15min，之后用流動相B(0.05%三氟乙酸-乙腈)0～100%梯度洗脫，洗脫峰在波長214nm處進行檢測，收集活性組分，冷凍干燥后，置于－20℃保存。

1.5 ACE抑制活性分析

ACE抑制劑活性測定[17]：色譜柱：C18柱(4.6mm× 250mm)；檢測波長：228nm；流動相：V(甲醇)： V(水)=30：70，含體積分數0.1%的三氟乙酸；流速：1mL/min。

將一定量的樣品溶于0.1mol/L、pH8.0、含0.3mol/L氯化鉀的硼酸鹽緩沖液(BBS)中，配制梯度質量濃度的樣品溶液。取40μL樣品溶液和20μL 0.1U/mL ACE的BBS溶液置于37℃恒溫水浴中保溫10min，加入100μL 5mmol/L HHL BBS作為底物，37℃條件下反應1h后加入50μL 1mol/L鹽酸中止反應，冷卻至室溫，取20μL反應產物進樣，通過HPLC 洗脫圖譜定量馬尿酸生成量，以馬尿酸的生成量來判斷樣品的ACE抑制率。ACE抑制劑的IC50的計算采用侯亞坤[16]的方法。

式中：A1為空白對照組中馬尿酸的峰面積/(mAU·s)；A2為加入樣品組中馬尿酸的峰面積/(mAU·s)。

1.6 N端氨基酸測序

純化后的ACE抑制劑經過埃德曼降解后，通過PPSQ-31A全自動蛋白/多肽序列儀測定氨基酸序列。

1.7 體外模擬消化實驗

純化后的ACE抑制肽的模擬消化實驗，按李華等[18]的方法稍加更改：模擬胃液：0.075g胃蛋白酶溶于10mL 0.1mo/L HCl溶液中；模擬腸液：0.05g胰蛋白酶與0.3g?；撬崛苡?5mL 0.1mol/L NaHCO3溶液中。

純化后的ACE抑制劑配制成一定質量濃度，取15mL于0.2mL模擬胃液混合，用1moL/L HCl調至pH2，于37℃條件下消化，6h后加入1mL模擬腸液用1mol/L NaHCO3調節pH7.8，于37℃繼續消化6h，反應結束后調pH值為中性，用截留分子質量1000D的超濾管離心(3000r/min、20min，4℃)除酶，所得濾液保存凍干并測定其ACE抑制率。

2 結果與分析

2.1 ACE抑制劑的分離純化

為了獲得核桃蛋白水解物，選取胃蛋白酶對其水解。以ACE抑制率作為分離篩選的判斷標準。

胃蛋白酶按照所列出的條件對核桃蛋白進行水解，水解后將所得樣品冷凍干燥，測定其(質量濃度為1mg/mL)ACE抑制活性，結果為20.79%，顯示出胃蛋白酶水解物有一定的ACE抑制作用。Hyun等[19]研究發現，牛血清蛋白的蛋白酶水解物隨著超濾截留的分子質量的減小，超濾物的ACE抑制活性逐漸升高。對胃蛋白酶水解液進行分子質量截留，超濾在4℃條件下進行，經過截留分子質量10kD超濾膜，去除蛋白酶與雜質，將濾液經過5kD的截留，對所得組分(0～5kD、5～10kD)分別測定其ACE抑制效果。所得結果，胃蛋白酶水解物0～5kD組分ACE抑制活性(IC50值為40.00μg/mL)較5～10kD組分ACE抑制活性(IC50值為126.34μg/mL)效果明顯。對0～5kD組分進一步進行Sephadex G-25凝膠層析分離。具有ACE抑制劑活性的分子質量低于5kD的凍干粉末，通過Sephadex G-25 Medium柱分離純化，洗脫峰在波長280nm處檢測并收集測定ACE抑制活性。分離結果見圖1，得到4個組分分別為P1、P2、P3、P4，各組分抑制ACE活性的IC50結果見圖2。比較各組分ACE抑制效果，其中P3的結果較突出，其IC50值為0.02mg/mL。

圖 1 胃蛋白酶水解物(0～5kD)活性組分經Sephadex G-25分離譜圖Fig.1 Separation of active components from walnut protein pepsin hydrolysate by Sephadex G-25 chromatography

圖 2 Sephadex G-25分離后所得胃蛋白酶水解物活性組分ACE抑制活性的IC50Fig.2 IC50 of the active components obtained by Sephadex G-25 chromatography

取Sephadex G-25分離純化所得ACE抑制活性最高的P3組分，經SuperdexTMPeptide 10/300 GL凝膠過濾色譜進一步分離純化分離結果見圖3，得到3個組分P3-1、P3-2、P3-3，分別測定其ACE抑制活性，所得結果見圖4，P3-3組分的ACE抑制效果較為突出其IC50為0.39μg/mL。

圖 3 活性組分P3經Superdex? Peptide 10/300柱分離譜圖Fig.3 Chromatography profi le showing the separation of active component 3 (P3) on Superdex? Peptide 10/300 column

圖 4 活性組分P3經Superdex? Peptide 10/300柱分離后所得組分的ACE抑制活性的IC50Fig.4 IC50 of three fractions (P3-1, 2 and 3) of active component 3

圖 5 活性組分P3-3經過反相高效液相色譜Zorbax SB-C18柱純化譜圖Fig.5 Chromatography profi le showing the separation of P3-3 on Zorbax SB-C18 column

將P3-3溶解于流動相A中，利用反相高效液相色譜進行純化，得到純度較高的組分，分離結果見圖5。測定其抑制ACE活性的IC50值為0.32μg/mL。

2.2 ACE抑制劑的結構分析

純化后的ACE抑制劑的氨基酸序列為酪氨酸-谷氨酸-脯氨酸(YEP)，其理論分子質量為407.43D。有研究表明天然的ACE抑制肽通常含有Pro、Lys以及一些芳香族氨基酸殘基[20]。

2.3 體外模擬消化實驗

模擬了胃液以及腸液的消化環境，經反相高效液相色譜純化所得ACE抑制劑進行體外模擬消化實驗。純化后的ACE抑制劑消化前后的ACE抑制活性基本保持不變(純化后的ACE抑制劑消化前ACE抑制的IC50值為0.32μg/mL，消化后ACE抑制的IC50值為0.36μg/mL)。結果表明，該抑制劑可以在體內消化環境中保持良好的穩定性及生物活性。

3 結 論

植物蛋白的天然成分對人類的疾病有著獨特的功效并且沒有人工合成藥物的副作用[20]，本實驗選取核桃粕作為蛋白源，充分挖掘了核桃粕的升值內涵，解決了生產中大部分核桃粕蛋白利用率偏低的問題。選擇內肽酶進行酶水解，其反應條件溫，專一性強。胃蛋白酶為內肽酶，有效的防止水解過程中產生過多的氨基酸[21]。在進行分離純化的過程中，黃家音等[22]提出利用分離原理不同的多種手段結合，所得到的目的產物將更純。本研究采用超濾去除大分子蛋白和多肽、在凝膠過濾色譜Sephadex G-25和SuperdexTMPeptide 10/300基礎上，又進行反相高校液相色譜純化，獲得IC50值為0.32μg/mL的高純度高活性的ACE抑制劑 YEP。模擬消化實驗結果表明該抑制劑在體內不會被進一步水解降低活性。ACE抑制劑可以通過合成的方式得到，利用合成的多肽，后期可以進行體內實驗和動物實驗，進一步驗證其降血壓能力，以及其他生物活性的測定。

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