蘆蒿秸稈總黃酮富集純化及產物鑒定

鄧榮華，郭宇星，李曉明，呂麗爽*

(南京師范大學金陵女子學院，江蘇 南京 210097)

蘆蒿(Artemisia selengensis Turcz)為菊科蒿屬植物，又名藜蒿、柳蒿、香艾蒿、狹葉艾等，為多年生草本植物。《神農本草經》把其列為“上品，甘、平，無毒，長毛發令黑，療心懸，少食常饑，久服輕身，耳目聰明，防衰之功效”。《本草綱目》記為“主治五臟邪氣，風寒濕脾，補中氣，利膈開胃，可去東河豚毒”[1]。蘆蒿風味獨特、營養豐富,且含有較多的黃酮類物質[2]，黃酮類物質具有抗氧化性，可以清除活性氧自由基，抑制產生自由基的某些酶的活性等功能[3-9]，開發前景廣闊。蘆蒿的藥用價值有清熱、去風濕、開胃等功效。民間也有用于治療急、慢性傳染性肝炎者，效果較好[10]。蘆蒿在南京八卦洲的種植面積達到3萬畝，年產量約5300萬kg，由于在生長末期極易木質化，八卦洲每年產生的木質化蘆蒿秸稈達2000萬kg，種植戶采用焚燒的方式對其進行處理，造成了環境污染。因此，為提高蘆蒿綜合利用價值，開展蘆蒿研究很有必要，同時，分離純化獲得高純度的蘆蒿秸稈總黃酮是新藥開發的重要前提。本實驗通過優選出較理想的大孔樹脂AB-8對蘆蒿秸稈總黃酮進行富集純化，并對純化后產物進行初步鑒定，以期為蘆蒿秸稈的開發利用提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘆蒿秸稈購于南京八卦洲，干燥粉碎后備用。

AB-8大孔樹脂 天津南開大學化工廠；蘆丁標準品 中國藥品生物制品檢定所；無水乙醇、檸檬酸、檸檬酸鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉、三氯化鋁、濃鹽酸、甲醇等均為分析純。

1.2 儀器與設備

PHS-3C-01 pH計 上海三信儀表廠；WFH-201B紫外透射反射儀 上海精科實業有限公司；RE52CS-1旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；SHZ-Ⅲ循環水式真空泵 南京科爾儀器設備有限公司；HH-6數顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司；HYG-C多功能搖床 太倉市實驗設備廠；電腦全自動部分收集器 上海青浦滬西儀器廠；UV-6100A型紫外-可見分光光度計 上海元析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蘆蒿秸稈總黃酮粗提液的制備[11]

蘆蒿秸稈→干燥粉碎→乙醇回流提取→冷卻→抽濾→離心→旋轉蒸發→蘆蒿秸稈總黃酮粗提液

1.3.2 蘆蒿秸稈總黃酮的測定

采用NaNO2-Al(NO3)3比色法[12]進行測定。

1.3.3 AB-8大孔樹脂靜態吸附和解吸動力學[13-14]

準確稱取一定質量(含干樹脂1.0013g左右)的經預處理的濕樹脂，置于150mL錐形瓶中，加入蘆蒿秸稈提取液(1.790mg/mL)50mL，封口，置于恒溫25℃搖床中，以140r/min速率進行吸附，每隔一定時間取樣并測定吸附后原液中總黃酮質量濃度。當樹脂吸附平衡后，將樹脂過濾，用蒸餾水洗去樹脂表面的總黃酮溶液后，用體積分數為70%的乙醇50mL于25℃振蕩解吸，每隔一定時間取樣測定解吸液中總黃酮質量濃度，分別計算樹脂的吸附量及解吸量。以時間為橫坐標，分別以每克樹脂中總黃酮的吸附量及解吸量為縱坐標繪制吸附和解吸動力學曲線，按式(1)～(3)分別計算吸附率、吸附量、解吸率和解吸量。

式(1)～(4)中：Co為吸附前溶液的總黃酮質量濃度/(mg/mL)；Ce為吸附后溶液的總黃酮質量濃度/(mg/mL)；V1為溶液的體積/mL；V2為解吸液體積/mL；E為吸附率/%；Qe為吸附量/mg；D為解吸率/%；Qd為解吸量/mg；Cd為解吸液總黃酮質量濃度/(mg/mL)。

1.3.4 AB-8大孔樹脂動態吸附

1.3.4.1 上樣液pH值對AB-8動態吸附率的影響[15]

采用規格為1.5cm×60cm的層析柱，將處理好的樹脂濕法裝柱，取相同體積的蘆蒿秸稈提取物，用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液調節上樣液pH值分別為3.02、4.08、5.00、6.06、7.02，以1mL/min流速上柱，吸附完全后，用2.0BV的蒸餾水洗柱，再用2.0BV 70%乙醇以1mL/min速率洗脫，將洗脫液濃縮，測定總黃酮質量濃度，計算樹脂吸附率。探討pH值與AB-8吸附率的關系，以確定純化工藝中最適的上樣液pH值。

1.3.4.2 上樣質量濃度對AB-8動態吸附效果的影響[16]

量取已知總黃酮質量濃度的蘆蒿秸稈提取液，分別用去離子水配制成上樣質量濃度和體積分別為0.738mg/mL和16mL、1.476mg/mL和8mL、2.952mg/mL和4mL、5.903mg/mL和2mL的溶液，其余操作同1.3.4.1節，探討上樣質量濃度對AB-8動態吸附效果的影響，以確定最合適的上樣質量濃度。

1.3.4.3 上樣量的確定[17]

將預處理過的樹脂濕法裝柱(柱體積為60cm3)，在上述確定的最適條件下，以1mL/min的流速連續上柱，每7mL收集一管，測定每管中總黃酮質量濃度隨流出體積的變化。將流出液中總黃酮質量濃度達到入口濃度10%的點，作為柱子的穿透點，此時對應的上樣量為最大上樣量。以流出液累積體積為橫坐標，流出液總黃酮質量濃度為縱坐標作圖，繪制蘆蒿秸稈總黃酮的泄露曲線。

1.3.5 AB-8大孔樹脂動態解吸

1.3.5.1 乙醇體積分數對AB-8動態解吸效果的影響[18]

加入相同體積的上樣液，在其他條件一致的情況下，分別用不同體積分數的乙醇溶液洗脫，比較不同體積分數乙醇溶液對AB-8解吸效果的影響，以確定最佳乙醇體積分數。

1.3.5.2 洗脫劑用量的確定[17]

將一定體積的上樣液按最佳條件上柱后，用蒸餾水沖洗到流出液為無色，按最佳的乙醇體積分數洗脫，10mL/管收集，同時測定各個管中的總黃酮質量濃度，繪制蘆蒿秸稈總黃酮的動態洗脫曲線。

1.3.6 AB-8柱純化前后總黃酮純度的比較[19]

按上述最佳條件進行AB-8柱層析實驗，收集洗脫液，濃縮凍干，得到初步純化產物，即蘆蒿秸稈總黃酮粗品(簡稱黃酮粗品)。將上柱前蘆蒿秸稈黃酮粗提物濃縮液冷凍干燥，得到黃酮粗提物。分別測定和計算總黃酮純度。

1.3.7 AB-8純化產物的初步鑒定

1.3.7.1 顯色反應[20]

分別進行還原實驗、金屬鹽類絡合反應、堿性顯色反應、硼酸顯色反應，觀察并記錄實驗現象。

1.3.7.2 紫外吸收光譜分析[21]

將純化后的樣品甲醇溶液在200～600nm進行紫外掃描，繪制“MeOH圖譜”，觀察特征吸收峰。

在黃酮類化合物溶液中加6滴AlCl3試劑，混合均勻后，進行紫外掃描，繪制“AlCl3圖譜”，然后加入3滴HCl溶液，混合均勻，進行紫外掃描，繪制“AlCl3/HCl圖譜”。

2 結果與分析

2.1 AB-8大孔樹脂靜態吸附和解吸動力學

圖 1 AB-8樹脂的靜態吸附及解吸動力學曲線Fig.1 Static adsorption and static desorption curves of AB-8 resin

由圖1可知，0～3.5h內，隨著吸附時間的延長，AB-8樹脂吸附總黃酮量增加，1.5h已經基本達到吸附飽和，吸附量達67.14mg/g樹脂，3.5h后達到飽和吸附量70.56mg/g樹脂，說明AB-8樹脂屬于快速平衡型樹脂。由解吸動力學曲線可知，在0.5h時，AB-8大孔樹脂解吸量為65.43mg/g樹脂，1.5h時達到最大解吸量66.77mg/g樹脂。結果表明，AB-8樹脂不僅具有較高的吸附量和解吸量，而且能快速地達到吸附平衡和解吸平衡，是富集純化蘆蒿秸稈總黃酮的理想樹脂。

2.2 AB-8大孔樹脂動態吸附

2.2.1 上樣液pH值對吸附率的影響

圖 2 上樣液pH值對吸附率的影響Fig.2 Effect of sample pH value on adsorption effi ciency

由圖2可知，上樣液pH值對樹脂吸附性能影響較大，pH3.02時吸附率較低，這可能是由于黃酮類化合物在強酸環境條件下常轉化為佯鹽，不容易被吸附上，使得吸附率降低；吸附率在pH4.08時達到最大，但隨著pH值的進一步增大，樹脂的吸附容量反而下降，可能原因是黃酮類化合物帶有酚羥基，呈弱酸性，故在微酸性條件下吸附較好。

2.2.2 上樣液質量濃度對動態吸附量的影響

圖 3 上樣質量濃度對吸附量的影響Fig.3 Effect of sample concentration on adsorption effi ciency

由圖3可知，隨著上樣液質量濃度增加，吸附量增大，當質量濃度增加到1.476mg/mL時吸附量最大，為10.36mg。當上樣液質量濃度進一步增加時，吸附量已飽和，過高的樣品質量濃度，反而會影響吸附效果，使得吸附量有所減少。這是因為總黃酮質量濃度較低時，提高總黃酮質量濃度可增加黃酮分子與樹脂的接觸，加速黃酮分子進入樹脂內部并迅速擴散，但隨著黃酮質量濃度的增大，與黃酮競爭吸附的雜質量也隨之加大，影響黃酮分子在樹脂內部的擴散，導致樹脂吸附量有所下降。因此，最佳的上樣質量濃度應控制在1.476mg/mL左右。

2.2.3 上樣量的確定

圖 4 AB-8樹脂泄漏曲線Fig.4 Leakage curve of AB-8 resin

由圖4可知，當上柱液體積達到70mL時，蘆蒿秸稈黃酮開始出現明顯的泄漏。隨著流出液體積的增加，流出液的總黃酮質量濃度逐漸增大，當流出液體積增至98mL時，泄漏曲線趨于平緩，即此時AB-8大孔樹脂對蘆蒿秸稈黃酮的動態吸附達到飽和，由此，可確定蘆蒿秸稈黃酮提取液最大上柱體積為樹脂體積的2.5倍。

2.3 AB-8大孔樹脂動態解吸

2.3.1 乙醇體積分數對解吸率的影響

圖 5 乙醇體積分數對動態解吸率的影響Fig.5 Effect of ethanol concentration on desorption effi ciency

由圖5可知，乙醇體積分數在60%～80%時，對AB-8樹脂解吸率影響不大，但乙醇體積分數過低或過高時，解吸率卻明顯下降，在乙醇體積分數達到60%左右時，解吸率最大，可能是由于體積分數為60%的乙醇的極性和蘆蒿秸稈總黃酮的極性更加接近，根據相似相溶的原理，體積分數為60%乙醇的解吸率較高。

2.3.2 洗脫劑用量的確定

圖 6 AB-8樹脂動態洗脫曲線Fig.6 Dynamic elution curve of AB-8 resin

由圖6可知，AB-8樹脂對蘆蒿秸稈黃酮有很好的洗脫能力。樹脂上吸附的黃酮物質極易洗脫，洗脫峰比較集中，當洗脫體積為50～70mL時，洗脫液中的總黃酮含量最高。洗脫劑用量為1.5BV時，黃酮基本被完全洗脫，在此基礎上，再增加洗脫劑用量，解吸量有所增加，但增幅很小。因此，從節約成本出發，宜以1.5～2.0BV左右的洗脫劑用量進行洗脫。

2.4 AB-8柱純化前后總黃酮純度的比較

經AB-8大孔樹脂吸附、解吸后，總黃酮純度由原來的5.80%變為30.26%，產品精制倍數為5.2倍，即產品純度提高到5.2倍，說明AB-8樹脂能夠有效地對蘆蒿秸稈總黃酮進行純化。

2.5 AB-8純化產物初步鑒定

2.5.1 顯色反應

由表1可知，在鹽酸-鎂粉反應過程中，發現反應溶液由黃色逐漸變成紅色，說明蘆蒿秸稈含有黃酮類化合物。醋酸鎂與雙氫黃酮作用后，在紫外光條件下可呈現顯著的藍色熒光，而其他黃酮類化合物則呈黃色，結果(表1)表明，蘆蒿秸稈含有雙氫黃酮類化合物。黃酮化合物與鉛鹽反應會生成黃色或紅色沉淀。沉淀色澤因羥基數目及位置不同而不同。其中，醋酸鉛只能與分子中具有鄰二酚羥基、3-羥基、4-酮基或5-羥基結構的化合物作用，蘆蒿秸稈樣品與鉛鹽反應有黃色沉淀生成，表明該提取物分子結構中極有可能含有鄰二酚羥基(3-羥基、4-酮基或5-羥基)。與NaOH溶液作用后呈棕色，表明蘆蒿秸稈中含有黃酮醇類。

表 1 蘆蒿秸稈總黃酮的顯色反應Table 1 Phenomena observed in the chromogenic reaction of total fl avonoids from

2.5.2 紫外吸收光譜分析

圖 7 樣品紫外-可見光譜圖Fig.7 UV-visible adsorption spectrum of the purifi ed product

黃酮類化合物由2個主要吸收帶組成，其中帶Ⅰ在300～400nm區間，由B環桂皮酰系統產生，帶Ⅱ在240～285nm區間，由A環苯甲酰系統產生。由圖7可知，樣品在229nm和328nm處有2個明顯的吸收峰，可能是由于甲基化和糖基化導致吸收帶向短波方向移動，致使樣品紫外吸收帶Ⅱ向短波方向移動，由于異黃酮、雙氫黃酮和雙氫黃酮醇的紫外光譜特征都具有強的帶Ⅱ吸收，而帶Ⅰ以帶Ⅱ的肩峰或低強度吸收峰出現，推斷蘆蒿秸稈黃酮中可能含有黃酮醇、異黃酮、黃烷酮和雙氫黃酮類。樣品甲醇溶液加入試劑AlCl3后，帶Ⅰ的最大吸收波長為351nm，加入HCl后帶Ⅰ的最大吸收波長減小為331nm。加酸后移動減小，指示鄰位雙OH存在，具體結構還需進一步鑒定。

3 結 論

本研究對上樣液pH值、上樣質量濃度、乙醇體積分數及洗脫劑用量的確定等影響AB-8樹脂純化的因素進行了研究，得出蘆蒿秸稈總黃酮純化的最佳工藝條件為吸附液pH4.0，上樣質量濃度1.476mg/mL，上樣流速1mL/min，最大上柱體積為樹脂體積的2.5倍，洗脫劑乙醇的體積分數為60%，洗脫流速1mL/min，最大洗脫體積為1.5～2.0BV左右。經純化后，產品中總黃酮的純度由5.80%增加到30.26%，提高到5.2倍，由此可見，AB-8樹脂是蘆蒿秸稈總黃酮良好的純化劑，對蘆蒿秸稈總黃酮有較高的吸附和解吸性能，適用于總黃酮的純化研究。通過顯色反應、紫外吸收特征光譜分析對純化產物進行鑒定，得知蘆蒿秸稈黃酮中可能含有黃酮醇、異黃酮、黃烷酮和雙氫黃酮類，并且結構中有鄰位雙OH存在，具體結構還需進一步鑒定。

[1] 劉偉, 董加寶. 蘆蒿的開發應用[J]. 中國食物與營養, 2006(7)： 22-23.

[2] 鄧丹雯, 鄭功源, 方繼平. 萎蒿黃酮提取方法研究[J]. 天然產物研究與開發, 2001, 13(6)： 48-50.

[3] PENG Changlian, LIN Zhifang, LIN Guizhu, et al. The antiphotooxidation of anthocyanins-rich leaves of a purple rice cultivar[J]. Sci China Ser C, 2006, 49(6)： 543-551.

[4] YAZAKI K, SUGIYAMA A, MORITA M, et al. Secondary transport as an efficient membrane transport mechanism for plant secondary metabolites[J]. Phytochem Rev, 2008, 7(3)： 513-524.

[5] ULANOWSKA K, MAJCHRZYK A, MOSKOT M, et al. Assessment of antibacterial effects of fl avonoids by estimation of generation times in liquid bacterial cultures[J]. Biologia, 2007, 62(2)： 132-135.

[6] WU Y, WANG F, ZHENG Q, et al. Hepatoprotective effect of total flavonoids from Laggera alata against carbon tetrachloride-induced injury in primary cultured neonatal rat hepatocytes and in rats with hepatic damage[J]. J Biomed Sci, 2006, 13(4)： 569-578.

[7] ONOUE S, YAMAUCHI Y, KOJIMA T, et al. Analytical studies on photochemical behavior of phototoxic substances; effect of detergent additives on singlet oxygen generation[J]. Pharmaceut Res, 2008, 25(4)： 861-868.

[8] ZHANG M, ZHANG J P, JI H T, et al. Effect of six flavonoids on proliferation of hepatic stellate cells in vitro[J]. Acta Pharmacol Sin, 2000, 21(3)： 253-256.

[9] HUANG Bo, BAN Xiaoquan, HE Jingsheng, et al. Hepatoprotective and antioxidant activity of ethanolic extracts of edible lotus(Nelumbo nucifera Gaertn.) leaves[J]. Food Chem, 2010, 120(3)： 873-878.

[10] 趙呈雷, 陳彥, 賈曉斌, 等. 萎蒿地上部分揮發油成分的氣-質聯用分析[J]. 中國藥房, 2006, 17(3)： 235-236.

[11] 呂麗爽, 黃健花, 周慶, 等. 蘆蒿中黃酮類化合物提取工藝研究[J]. 食品工業科技, 2002(9)： 48-49.

[12] 嚴建剛. 芹菜黃酮提取及其抗氧化與降血脂作用研究[D]. 楊凌： 西北農林科技大學, 2004.

[13] 林建委, 邵干輝. 山竹果殼黃酮的抗氧化性及在卷煙中應用效果初探[J]. 現代食品科技, 2011, 27(7)： 816-849.

[14] Lü Lishuang, TANG Jian, HO C T. Selection and optimization of macroporous resin for separation of stilbene glycoside from Polygonum multifl orum Thumb.[J]. Journal of Chemical Technology & Biotechnology, 2008, 83(10)： 1422-1427.

[15] 楊樂, 王洪新, 秦曉娟. 大孔樹脂純化筍殼中的黃酮物質[J]. 食品與生物技術學報, 2011, 30(2)： 218-223.

[16] 曾永長, 梁少瑜, 邢學峰, 等. 白花蛇舌草總黃酮的大孔吸附樹脂純化工藝[J]. 中國實驗方劑學雜志, 2010, 16(18)： 26-29.

[17] 陳蕉黎, 黎云祥, 陳光登, 等. 大孔吸附樹脂分離純化娥嵋巖白菜葉總黃酮[J]. 食品科學, 2010, 31(6)： 74-79.

[18] 焦巖, 王振宇. 大孔樹脂純化大果沙棘果渣總黃酮的工藝研究[J]. 食品科學, 2010, 31(16)： 16-20.

[19] 賀波. 苧麻葉黃酮的提取、分離純化、結構及抗氧化活性的研究[D]. 武漢： 華中農業大學, 2010.

[20] 徐宗海. 達烏里胡枝子中黃酮類成分的研究[D]. 楊凌： 西北農林科技大學, 2010.

[21] 尚久方, 胡華強. 黃酮類化合物結構鑒定技術[M]. 北京： 科學出版社, 1990.