食源性明膠多肽的制備、分離及其抗凍活性

汪少蕓，趙立娜，周焱富，饒平凡

(福州大學生物科學與工程學院，福建 福州 350002)

眾多食品在低溫冷鏈上的冷凍、貯存、運輸和凍融過程中的冰晶生長和重結晶問題是制約產品品質的關鍵[1-4]。溫度的反復波動使產品不斷遭受冰晶生長、凍融和重結晶，損傷細胞和組織結構，使產品失去應有的品質，其導致的質量破壞和巨大經濟損失越來越受到人們的關注[1-3]。如何控制低溫冷鏈過程中產品的冰晶生長及重結晶，是保證眾多食品在低溫運輸和貯存過程中品質不發生劣變的關鍵[1-2]。

抗凍蛋白是一類附著在冰晶體表面而抑制冰晶的生長和重結晶的活性蛋白質[5-7]。近年來國內外對抗凍蛋白的研究十分活躍[8-14]。目前的研究主要集中在從極地魚類[15-17]、陸地昆蟲[18-19]、植物[20-21]和細菌[22]等生物體中分離到多種抗凍蛋白，并尋求它們在食品、醫學和其他工業上的應用[6,23]。天然分離純化得到的抗凍蛋白數量極少，限制了其在食品工業中的應用。當科學家致力于轉基因技術以提高生物體來源的抗凍蛋白產量時，轉基因抗凍蛋白在食品應用中的安全性顧慮則成為廣大消費者、歐盟組織和食品藥品管理組織(FDA)共同擔憂的焦點[2,22]。研究[24-25]表明，抗凍蛋白的抗凍活性片斷只存在于局部的特異多肽鏈結構域中，并不是整體蛋白質在起作用，因此，如何獲得食品源的結構緊湊的高活性抗凍多肽，已成為抗凍蛋白新的研究方向。

本實驗以食用明膠為原材料，通過控制內切蛋白酶的酶解條件，使之產生具有特定的肽鏈長度和結構組成的活性多肽，使抗凍活性得以高效實現，以期為食品源抗凍多肽的制備提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

食源性明膠(225B40牛明膠) 美國Sanofi生物有限公司；冰淇淋基體為自制，其配方為：l2%乳脂、9%～12%脫脂奶粉、10%～16%蔗糖、0.1%乳化劑，其余為水。

堿性蛋白酶(EC 3.4.22.2，酶活力264U/g) 美國Sigma試劑公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

Sephadex G-50凝膠過濾色譜柱(100cm×2.6cm，(100～300)μm)、SP Sephadex C-25離子交換色譜(55cm×2.0cm，(40～120)μm) 美國Pharmacia公司；Bondapak C18高效液相色譜柱(250mm×4.6mm，10μm) 美國Waters公司；多倍低溫顯微鏡、自動照相系統 日本Nike公司；MALDI-TOF質譜儀 美國Applied Biosystems公司。

1.3 方法

1.3.1 抗凍活性檢測體系的確定

利用抗凍活性冷-熱循環(cold-heat-stage)檢測系統，結合多倍低溫顯微鏡和自動照相系統，組構抑制冰晶生長的抗凍活性檢測系統。以液氮維持操作過程中的低溫環境。以每3min為1個循環使其保持在―14～―12℃之間，模擬產品在低溫貯存運輸過程中的溫度波動。利用冰淇淋基體為研究載體，將樣品置于載玻片上，記錄樣品在冷熱循環過程中的冰晶生長實時圖片，并與空白對照組作比較；利用統計學分析，對冰晶的平均直徑和面積進行顯著性分析，計算其晶體生長差異的規律性。冰晶的數目及大小較空白對照組樣品減少，則表明樣品具有抑制冰晶生長的能力。共進行7次循環，顯微像320倍予以記錄。

1.3.2 抗凍多肽的制備條件單因素試驗

配制20%的明膠溶液，根據預實驗結果，控制pH9.0，分別優化酶與底物比、酶解時間、酶解溫度等抗凍多肽制備條件。酶解結束后將水解液在沸水中處理5min，即終止水解。

1.3.2.1 明膠酶解制備抗凍多肽的料液比單因素試驗

根據預實驗結果，控制酶解溫度37℃、pH 9.0、酶解時間30min，酶與底物比分別為1：100、1：50、1：25、1：15和1：10時，測定不同酶與底物比條件下酶解物抑制冰晶生長情況，計算抗凍活性大小，確定明膠酶解制備抗凍多肽的料液比。

1.3.2.2 明膠酶解制備抗凍多肽的酶解時間單因素試驗

控制酶解溫度37℃、pH9.0、酶與底物比1：15，酶解時間分別為10、20、30、40、60min時，測定不同酶解時間條件下的抑制冰晶生長情況，計算抗凍活性大小，確定明膠酶解制備抗凍多肽的酶解時間。

1.3.2.3 明膠酶解制備抗凍多肽的酶解溫度單因素試驗

控制酶解時間30min、pH9.0、酶與底物比1：15，酶解溫度分別為37、45、55℃時，測定不同酶解溫度條件下的抑制冰晶生長情況，計算抗凍活性大小，確定明膠酶解制備抗凍多肽的酶解溫度。

1.3.3 抗凍多肽的分離純化

1.3.3.1 凝膠色譜

抗凍多肽酶解物用Sephadex G-50凝膠過濾色譜柱進行分離，洗脫液為pH7.0 0.01mol/L的磷酸緩沖液(PBS)，以1mL/min流速收集樣品(5mL/管)，測定樣品在225nm波長處的吸收值，繪制洗脫曲線。分別測定所收集樣品的抑制冰晶生長情況，計算冰晶尺寸，并用來表示抗凍活性大小。

1.3.3.2 離子交換色譜

收集Sephadex G-50凝膠過濾色譜分離的抗凍活性組分，采用SP Sephadex C-25離子交換色譜進一步分離，樣品平衡液為pH5.4 0.01mol/L的PBS緩沖液，用0～0.5mol/L的NaCl溶液進行梯度洗脫。以1mL/min流速收集樣品(5mL/管)，測定樣品在225nm波長處的吸收值，繪制洗脫曲線。分別測定所收集樣品的抑制冰晶生長情況，計算冰晶尺寸，并用來表示抗凍活性大小。

1.3.3.3 反相高效液相色譜

收集SP Sephadex C-25離子交換色譜的抗凍活性組分，采用C18高效液相色譜柱進一步分離；進樣量為100μL；流動相的A液為去離子水，B液為乙腈；流速為3.0mL/min，測定樣品在225nm波長處的吸收值，繪制洗脫曲線。分別測定所收集樣品的抑制冰晶生長情況，計算冰晶尺寸，并來表示抗凍活性大小。

1.3.4 質譜鑒定

收集分別通過Sephadex G-50凝膠過濾色譜、SP Sephadex C-25離子交換色譜和C18高效液相色譜柱分離的強抗凍活性的特異性多肽，利用MALDI-TOF質譜，鑒定其分子質量大小。

1.3.5 氨基酸序列測定

利用蛋白質固相序列分析儀，根據Edman降解法測定強抗凍活性特異性多肽的氨基酸全序列，并分析序列結果。

1.4 數據處理與統計

數理統計分析采用t檢驗，當P＜0.05時，具有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 抗凍多肽的制備條件單因素試驗

2.1.1 酶解制備抗凍多肽的酶與底物比優化

圖 1 不同酶與底物比條件下酶解物的抑制冰晶生長圖Fig.1 Effect of gelatin hydrolysate from different [E]/[S] ratios on the growth of ice crystal in ice cream.

圖 2 不同酶與底物比的明膠酶解物的冰晶抑制結果Fig.2 Inhibitory effect of gelatin hydrolysate from different [E]/[S] ratios on the growth of ice crystal

由圖1、2可知，隨著酶與底物比逐漸增大，產生的冰晶尺寸逐漸減少，當酶與底物比為1：10時，冰晶則出現增大趨勢。采用數理統計計算冰晶尺寸的平均大小，可以直觀看出抗凍活性大小。因此確定明膠酶解制備抗凍多肽的最適酶與底物比為1：15。

2.1.2 酶解制備抗凍多肽的酶解時間優化

由圖3、4可知，當酶解時間從10min延長至20、30min時，冰晶的尺寸逐漸減少，抗凍活性逐漸增加；而當酶解時間繼續增大至40、60min時，產生的酶解液冰晶尺寸增大，抗凍活性下降。所以明膠酶解制備抗凍多肽的酶解時間以30min為宜。

圖 4 不同酶解時間的明膠酶解物的冰晶抑制結果Fig.4 Inhibitory effect of gelatin hydrolysate from different hydrolysis time on the growth of ice crystal

2.1.3 酶解制備抗凍多肽的酶解溫度優化

圖 5 不同酶解溫度條件下酶解物的抑制冰晶生長圖Fig.5 Effect of gelatin hydrolysate from different temperatures on the growth of ice crystal in ice cream

圖 6 不同酶解溫度條件下的明膠酶解物的冰晶抑制結果Fig.6 Inhibitory effect of gelatin hydrolysate from different temperatures on the growth of ice crystal

由圖5、6可知，45℃酶解液的冰晶尺寸最小，生長抑制能力最強。因此優化出制備抗凍多肽的酶解溫度為45℃。

2.2 抗凍多肽的分離純化

2.2.1 凝膠色譜

圖 7 Sephadex G-50凝膠過濾色譜分離圖Fig.7 Elution pattern of Sephadex G-50

圖 8 Sephadex G-50凝膠過濾色譜分離組分F1、F2和F3的抑制冰晶生長情況Fig.8 Effect of fractions 1, 2 and 3 from Sephadex G-50 on the growth of ice crystal

由圖7、8可知，根據F1、F2、F3洗脫峰的抑制冰晶生長情況，可以得到洗脫峰F3的抗凍活性最顯著(P＜0.05)。

2.2.2 離子交換色譜

圖 9 SP Sephadex C-25離子交換色譜分離圖Fig.9 Elution pattern of Sepharose SP C-25

圖 10 SP-Sephadex C-25離子交換色譜分離組分S1和S2的抑制冰晶生長圖Fig.10 Effect of fractions 1 and 2 from SP-Sephadex C-25 on the growth of ice crystal

如圖9、10所示，對洗脫峰S1、S2充分透析脫鹽，根據其其抑制冰晶生長情況，得到洗脫峰S2的抗凍活性最顯著(P＜0.05)。

2.2.3 反相高效液相色譜

圖 11 C18-HPLC 色譜分離圖Fig.11 Elution pattern of C18-HPLC

圖 12 C18 RPLC色譜分離組分C1和C2的抑制冰晶生長圖Fig.12 Effect of fractions C1 and C2 from C18-HPLC on the growth of ice crystal

如圖11、12所示，對收集的樣品充分去除揮發性溶劑后，通過抑制冰晶生長情況計算抗凍活性大小，得到洗脫峰C2的抗凍活性最顯著(P＜0.05)。

2.3 質譜鑒定

圖 13 MALDI-TOF質譜鑒定抗凍多肽分子質量Fig.13 Molecular weight (MW) of antifreeze fraction C2 by MALDI-TOF

由圖13可知，具有顯著活性的抗凍多肽分子質量為 2107D。

2.4 氨基酸序列分析

根據Edman降解法測定強抗凍活性特異性多肽的氨基酸全序列，并進行序列分析，獲得其氨基酸全序列即一級結構為：GERGFPGERGSPGAQGLQGPR。

2.5 二級結構及作用機理推測

具有特定氨基酸長度和序列的強抗凍活性多肽C2，其來源于食源性明膠。明膠來源于膠原蛋白，膠原蛋白的結構是三股α螺旋結構，故推測明膠多肽的二級結構表現為α螺旋，具有α螺旋的強抗凍活性多肽的螺旋鏈中—NH基團和冰分子的—OH形成氫鍵—N—H…O—H(圖14)，多肽通過氫鍵結合于冰核棱晶的表面，從而抑制了其生長。而且，分子質量2107D的肽鏈具有足夠的親水性、柔韌性，加上明膠多肽富含的脯氨酸和丙氨酸殘基的烷基側鏈可以提供部分的非極性環境通過疏水作用以穩定多肽和冰之間形成的氫鍵[12-13]，并能夠對抗冰水之間氫鍵相互作用的競爭性，使之表現出顯著的冰晶抑制活性。

圖 14 抗凍多肽與冰結構分子表面形成氫鍵的模型Fig.14 Model of hydrogen bonds between antifreeze peptide and the surface of ice molecules

3 結 論

以食源性明膠為原材料，通過控制堿性蛋白酶的酶解條件，使之酶切為特定的活性多肽，使得抗凍活性得以高效實現。對得到的抗凍多肽溶液通過Sephadex G-50、SP Sephadex C-25、C18RPLC色譜分離和MALDI-TOF質譜鑒定，最終得到分子質量為2107D的強抗凍活性多肽。其可能的作用機理為具有α螺旋的強抗凍活性多肽在冰晶的棱晶面內與水分子形成氫鍵，多肽通過氫鍵結合于冰核棱晶的表面，從而抑制冰晶長大。本研究結果將為食源性抗凍多肽的制備及探索其在食品領域的廣泛應用提供一定的依據。

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