谷氨酰胺酶基因原核表達載體的構建與表達

盧 彪，吳擁軍*，吳玉俊，羅 熹，劉艷敏

(貴州大學生命科學學院，貴州 貴陽 550025)

谷氨酰胺酶(glutaminase，GA，EC 3.5.1.2)廣泛存在于包括細菌、酵母菌、真菌等微生物中，具有γ-谷氨酰基轉移能力和谷氨酰胺水解活力。主要水解L-谷氨酰胺成L-谷氨酸和氨，在生物體氮代謝過程中扮演著重要作用，是谷氨酰胺分解的關鍵酶和限速酶[1-2]。將谷氨酰胺酶作為食品工業用酶己有100多年的歷史[3]。谷氨酸被認為是醬、醬油等大豆發酵食品中主要的鮮味物質[4]，而谷氨酸形成的鈉鹽谷氨酸鈉(味精)是目前國內外廣泛使用的增鮮調味品之一。經調查貴州水豆豉生產企業得知，味精的使用成本約占總成本的25%～30%左右。如能通過安全方式將高活性的GA酶編碼基因整合至水豆豉主要發酵菌株枯草芽孢桿菌[5]中并表達其活性，將大量減少味精的添加量降低企業生產成本。

實驗室前期已獲得豆豉生產菌株BJ3-2[5]，其GA酶活性較低；并從高谷氨酰胺酶活性的枯草芽孢桿菌株中克隆了glsA2基因[6]。本研究旨在通過驗證glsA2在原核系統中表達GA酶的活力，為今后發酵生產和食品級改良置換BJ3-2的glsA1[6]基因奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株與質粒

菌株：E.coli BL21(DE3)、E.coli DH5α為本實驗室保存。

質粒：pET-32a、pMD18-glsA2為本實驗室保存。

1.2 試劑與儀器

質粒提取試劑盒、DNA純化試劑盒 美國Omega公司；Bacterium Glutaminase Assay Kit 美國Genmed公司；Taq酶、限制性內切酶、T4 DNA連接酶、DNA Marker等 日本TaKaRa公司；其他試劑均為國產分析純。

MyLycler PCR儀、Universal Hood凝膠成像分析儀、Powerpac HC電泳儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 重組質粒pMD18-glsA2的提取[7]

將含有重組質粒的pMD18-glsA2的E.coli DH5α接種于氨芐青霉素終質量濃度為100μg/mL的5mL LB液體培養基中，37℃、180r/min搖床過夜培養。取2mL菌液使用質粒小量試劑盒進行質粒提取；通過瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.3.2 表達載體pET32a-glsA2的構建

1.3.2.1 引物設計

根據glsA2基因序列及pET-32a的多克隆位點情況設計引物：Pga F：CGGGATCCATGCAGTGCATTGAAAC(BamHⅠ)，Pga R：CGGAATTCTTAGCTCCAACCTTCTTG(EcoRⅠ)[8]。

1.3.2.2 PCR擴增[9]

glsA2基因PCR擴增反應體系為20μL；反應參數為：94℃、5min； 94℃、45s，52℃、40s，72℃、50s，30個循環；72℃延伸8min，4℃保存。

1.3.2.3 pET32a-glsA2的構建

對PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，并利用膠回收試劑盒進行回收。使用BamHⅠ和EcoRⅠ對回收產物及pET-32a進行雙酶切，回收的酶切產物以T4 DNA連接酶連接[10]，連接產物轉化E.coli BL21(DE3)[11]。通過菌落及質粒PCR[12]并質粒酶切鑒定[13]，獲得重組表達載體pET32a-glsA2。

1.3.2.4 重組表達載體在大腸桿菌中的優化表達

陽性重組子于5mL含100μg/mL氨芐青霉素的液體M9培養基[14-15]中，置37℃培養過夜，取50μL菌液加入50mL含100μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養基中37℃、180r/min培養至OD600nm值約為0.6[16]。加入終質量濃度為0.5mmol/L的IPTG進行誘導，誘導時間分別為2、3、4、5、6、7、8、9h[17]。確定最佳誘導時間后再設置0、0.01、0.025、0.05、0.075、0.1、0.25、0.5mmol/L IPTG終濃度進行誘導[18]。

1.3.2.5 SDS-PAGE檢測表達情況[19-20]

取誘導后的菌液1mL，12000r/min離心去上清。沉淀懸于100μL SDS上樣緩沖液，100℃水浴3min后12000r/min離心取上清點樣進行電泳。

1.3.2.6 重組菌株谷氨酰胺酶活力測定

最優誘導表達條件下對重組菌株利用細菌谷氨酰胺酶活性定量檢測試劑盒進行酶活力檢測。谷氨酰胺酶單位活性定義為：在37℃、pH8.6條件下，每分鐘能夠轉化1μmol谷氨酰胺至谷氨酸所需的酶量作為一個活力單位。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增glsA2基因

圖 1 PCR擴增glsA2基因Fig.1 PCR amplifi cation of glsA2 gene from pMD18-glsA2

由圖1可知，PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測獲得大小約924bp片段，與預期大小一致。

2.2 重組表達載體pET32a-glsA2質粒PCR檢測及酶切結果

通過菌落PCR篩選得到的陽性菌株后提取陽性菌株的質粒DNA為模板，通過PCR擴增glsA2基因，結果在924bp處出現一特異性條帶，所獲得的基因片段大小與glsA2基因大小相吻合，表明目的基因己與表達載體pET-32a發生了重組。

圖 2 重組質粒pET32a-glsA2酶切鑒定Fig.2 Restriction digestion of recombinant plasmid pET32a-glsA2 with BamHⅠand EcoRⅠ

由圖2可知，通過限制性內切酶對重組子pET32a-glsA2進行雙酶切，酶切片段與預期大小一致，表明glsA2基因己插入表達載體pET-32a中，并成功發生了重組，即預期獲得重組表達載體pET32a-glsA2重組子。

2.3 IPTG誘導表達優化

2.3.1 最佳誘導時間

圖 3 時間梯度誘導的SDS-PAGE分析Fig.3 Changes in time course of recombinant glutaminase expression in E. coli

將時間梯度誘導的陽性重組子進行SDS-PAGE分析。如圖3所示，陽性重組子經誘導后出現特異性目的蛋白條帶(箭頭所示位置)，而在同一位置的空載體未出現條帶(泳道C)；IPTG誘導時間為6h(箭頭所示)時蛋白表達量最高。

2.3.2 最佳IPTG誘導濃度

設置IPTG濃度梯度對重組子6h誘導表達后進行SDSPAGE鑒定。由圖4可知，隨著IPTG濃度增加目的蛋白表達量也隨之增加，當IPTG濃度達到0.1mmol/L時，目的蛋白表達量達到最大(箭頭所示條帶)，隨后IPTG濃度繼續增加目的蛋白的表達量反而有所降低。

圖 4 IPTG濃度梯度誘導的SDS-PAGE分析Fig.4 Expression of recombinant glutaminase induced at gradient concentrations of IPTG

2.4 重組pET32a-glsA2酶活力

在最優誘導條件下對pET-32a、pET32a-glsA2谷氨酰胺酶活力進行測定，兩株菌的酶活力分別為40.2、608.2U/μg。重組菌株pET32a-glsA2酶活力約為對照pET-32a/BL21的15倍。

3 討 論

通過構建谷氨酰胺酶基因glsA2原核表達載體pET32aglsA2，并在E.coli BL21(DE3)中進行優化表達初步確定了其最佳誘導條件。對枯草芽孢桿菌來源的glsA2在大腸桿菌中高谷氨酰胺酶活性的表達進行了驗證。

對IPTG誘導濃度進行研究時，最初選用的培養基為LB培養基。但在未添加IPTG時重組蛋白仍然表達，并在SDS-PAGE中出現明顯條帶。推測原因為LB培養基組分中的胰蛋白胨或酵母提取物中含有乳糖或其類似物，使其在未添加IPTG時仍能促使重組蛋白表達。后來改用成分清晰的M9培養基后再進行實驗驗證，結果顯示在未添加IPTG誘導或添加終濃度小于0.01mmol/L時SDS-PAGE檢測不到重組蛋白條帶，從而證明推測結果正確。

對影響誘導表達的兩個關鍵因素(誘導時間和IPTG濃度)進行了單因素優化。其他因素如添加IPTG時的菌齡為OD600nm值為0.6及最適培養基等則是參考了pET表達手冊的方案，未進行實驗驗證。

谷氨酰胺酶基因glsA2是從高酶活枯草芽孢桿菌菌株GA317中克隆得到的，可用于食品級菌株的改良。實驗對谷氨酰胺酶基因glsA2在E.coli BL21(DE3)中通過原核表達載體pET32a-glsA2進行的酶活力表達進行了驗證。高酶活谷氨酰胺酶基因用于食品發酵微生物的改造尚未見報道，如果能實現食品級改良發酵菌株提高其產谷氨酸能力將在食品發酵行業具有較大應用價值。

[1] NANDAKUMARA R, YOSHIMUNEB K, WAKAYAMAC M, et al. Microbial glutaminase： biochemistry, molecular approaches and applications in the food industry[J]. Enzymatic, 2003, 23(9)： 87-100.

[2] FRANKENBERGER W T, Jr, TABATABAI M A. L-glutaminase activity of soils[J]. Soil Biology and Biochemistry, 1991, 23(9)： 869-874.

[3] KOIBUCHI K, NAGASAKI H, YUASA A, et al. Molecular cloning and characterization of a gene encoding glutaminase from Aspergillus oryzae[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2000, 54(1)： 59-68.

[4] 宋美. 大豆分離蛋白水解產物呈鮮味組分的制備及性質研究[D]. 北京： 中國農業大學, 2006.

[5] 賈東旭, 吳擁軍, 李耀中, 等. 細菌型豆豉發酵芽孢桿菌的篩選與鑒定[J]. 食品科學, 2009, 30(5)： 217-221.

[6] 詹壽年, 吳擁軍, 郭倩倩, 等. 高活性谷氨酰胺酶豆豉芽孢桿菌的篩選及glsA基因的克隆[J]. 貴州農業科學, 2011, 39(6)： 119-122.

[7] 朱芳, 鄧思, 羅立新. 分選酶A在pET32a(+)原核表達載體中的表達和鑒定[J]. 生物技術通報, 2011(6)： 219-222.

[8] 聞潔君, 江文正, 郝文麗, 等. HIV-1 nef基因的克隆及原核表達研究[J]. 細胞與分子免疫學雜志, 2010, 26(4)： 348-350.

[9] 王文凱, 鐘橋, 謝立蘋, 等. 幽門螺桿菌cag4蛋白的原核表達、純化及鑒定[J]. 中國免疫學雜志, 2011, 27(4)： 347-351.

[10] 聞潔君, 江文正, 郝文麗, 等. HIV-1 nef基因的克隆及原核表達研究[J]. 細胞與分子免疫學雜志, 2010, 26(4)： 348-350.

[11] 吳行偉, 劉澤源, 李前, 等. 質粒pBV220-PTD-tCNTF轉化BL2菌株感受態細胞的高效制備方法[J]. 中國藥理學通報, 2012, 28(4)： 584-587.

[12] 張曉莉, 馮瑩穎, 張強, 等. Triton X-100在單菌落PCR技術中的優化作用[J]. 化學與生物工程, 2009, 26(6)： 82-85.

[13] 張海峰, 李景榮, 唐麗杰, 等. 重組犬IFN-γ在大腸桿菌中的高效表達[J]. 農業生物技術學報, 2005, 13(5)： 639-643.

[14] 劉順誼, 殷志敏. 重組枯草芽孢桿菌谷氨酰胺合成酶蛋白在改良M9培養基中的誘導表達[J]. 南京師范大學學報： 自然科學版, 2007, 30(4)： 74-79.

[15] 王海波, 歐俊杰, 耿信篤. 基因工程菌生產rhG-CSF發酵培養基的研究[J]. 中國生物工程雜志, 2003, 23(11)： 68-71.

[16] 張婷婷, 王春麗, 韓蕊蓮, 等. 丹參C4H基因pET32a原核表達載體的構建[J]. 西北農林科技大學學報： 自然科學版, 2011, 39(7)： 159-162.

[17] 丁嵐, 侯曉彥, 王小紅, 等. 乳糖誘導葡萄球菌腸毒素A基因在大腸桿菌中的表達[J]. 食品與生物技術學報, 2011, 30(2)： 255-260.

[18] 孟凡榮, 司志飛, 劉昊英, 等. 小麥TaMBD2原核表達載體的構建和誘導表達[J]. 植物生理學通訊, 2008, 44(5)： 860-864.

[19] 薩姆布魯克J, 拉塞爾D W. 分子克隆實驗指南[M]. 3版. 北京： 科學出版社, 2002： 1229-1236.

[20] 王劼, 蔣思文, 彭健. 重組K88黏附素亞單位蛋白在大腸桿菌中的誘導表達[J]. 農業生物技術學報, 2006, 14(6)： 957-962.