大腸桿菌重組表達磷脂酶C的發酵工藝優化

趙金星，張 梁，顧正華，丁重陽，石貴陽

(江南大學 食品科學與技術國家重點實驗室，工業生物技術教育部重點實驗室，糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇 無錫 214122)

磷脂酶C(PLC，EC3.1.4.3) 廣泛存在于微生物和動植物的組織和細胞中，到目前為止已發現20多種不同的PLC分子結構。PLC可水解甘油磷脂C3位點甘油磷酸脂鍵，生成甘油二酯(DAG)和磷酸單酯[1]，磷脂酶C的活性需要Zn2+、Mg2+等金屬離子激活。

PLC在抗血小板新藥研究[2-4]、高血壓[5]等病理研究以及食品工業添加劑、油脂精煉等方面都有應用。但是從長遠角度來看，磷脂酶C應用于油脂酶法脫膠最具工業應用前景。從目前的研究結果來看，酶法脫膠的效果較好，但使用的酶主要是Novoeymes公司推出的2款磷脂酶-Lecitse Novo和Lecitase Ultra，對于大宗油脫膠來說，成本較高。目前國內尚無商業化磷脂酶，國內的工業用磷脂酶主要依賴進口，國外能夠引進工業應用的磷脂酶只有諾維信A/S鏈霉菌屬來源磷脂酶和鐮刀菌屬磷脂酶來源磷脂酶A。雖然有研究表明利用磷脂酶C進行油脂精煉可以將油耗降低3.6%，但是由于磷脂酶C產量較低，工業化應用價值還不能很好的體現。

鑒于磷脂酶C在醫藥、食品等工業特別是油脂脫膠領域的應用前景，相關研究正愈發受到重視。由于野生微生物菌株磷脂酶產量較低，并且已知的大多數微生物來源磷脂酶C都以毒素因子的形式存在于致病性的病原體中，異源表達雖得到了一定的效果，但是離工業化生產的要求還有一定的距離，導致磷脂酶C的價格比較昂貴，磷脂酶C的工業應用受到限制。研究合適的磷脂酶C表達體系并進行工藝優化，對促進磷脂酶C的發酵產業化及工業應用具有重要的學術與實踐價值。

微生物來源的磷脂酶C結構一般較為簡單，目前已經從多種微生物中分離得到。國內研究起步較晚，但也取得了一定的成果，自1989年至今分別對黏質沙雷氏武漢菌株[6]、Bacillus cereus[7]、哈維氏弧菌[8]和B. mycoide[9]產磷脂酶C菌株進行了誘變、產酶性質及發酵工藝等研究。國外對微生物磷脂酶C的研究起源于20世紀的60年代，多株細菌來源的磷脂酶C基因相繼被克隆并對其底物特異性、酶學性質等進行了較為深入的研究[10]，國內除本課題組成功實現不同來源磷脂酶C的重組表達外，公開報道的最高酶活力為26U/mL。

本課題組近年來也對磷脂酶C進行了較為系統的研究，篩選獲得了多株磷脂酶C高產菌株，并在國內首次實現了B. cereus磷脂酶C基因的重組表達[10]，研究分析了Pseudomonas aeruginosa來源各磷脂酶C的特性并構建了高產菌株，在LB培養基中的初步發酵實驗即獲得了較高酶活[11]。但是在用LB培養基進行上罐發酵時，與搖瓶發酵時相比，不論是添加甘氨酸前后，總酶活力的提升幅度都較小，原因可能是LB培養基中菌體量無法有效增長，難以高密度培養。本實驗以實驗室前期構建的重組大腸桿菌BL21(DE3)/pET28a-plcH為出發菌株，進一步在搖瓶中對其發酵工藝進行優化，并在7L發酵罐中進行了工藝驗證。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

重組大腸桿菌BL21 (DE3)/pET28a-plcH，本實驗室前期構建并保藏。

p-NPPC (p-nitrophenylphosphoryl cholone，p-NPPC)美國Sigma公司；其他試劑均為分析純。

1.2 培養基

LB(luria-bertani)液體培養基；TB(terrific broth)培養基；TB-TH培養基(g/L)：稱取12g蛋白胨、24g酵母提取物和5g甘油加入到1L的Tris-HCl (0.25mol/L，pH 7.2～7.4)緩沖液中，1×105Pa高壓滅菌20min。

1.3 方法

1.3.1 酶活力的檢測

反應體系構成參考文獻[12]，酶活力單位的定義參考文獻[13]。

1.3.2 發酵培養基的比較

考察LB、TB兩種培養基的產酶情況，誘導方法：取保藏于甘油管中的重組大腸桿菌50μL于37℃、200r/min振蕩培養10h，次日以5%接種量轉接至50mL終質量濃度為100μg/mL的Kana-LB或TB液體培養基中，37℃、150r/min培養4h，加入IPTG至終濃度為1.0mmol/L，25℃、150r/min誘導6～10h。誘導結束時測量發酵液OD600nm值，取等量發酵液破碎測定酶活力。

1.3.3 TB培養基中碳源的優化

以下優化的發酵條件為：取保藏于甘油管中的重組大腸桿菌50μL，接種于裝有30mL的Kana-LB液體培養基的250mL三角瓶中，37℃、200r/min培養10h，然后以5%的轉接量轉接于若干裝有50mL的Kana-TB-TH液體培養基的250mL三角瓶中，37℃、200r/min振蕩培養4h后添加IPTG至終濃度為1.0mmol/L，誘導6 h后收集細胞并破碎，酶活力測定方法同1.3.1節。

碳源的確定：按照碳源的添加量相同的原則，選擇麥芽糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖、可溶性淀粉、糊精、殼聚糖7種碳源分別替代TB培養基中的甘油，并與甘油做對比，誘導后根據酶活力測定結果，選擇合適的碳源。碳源添加量的確定：根據上述結果，配制含不同質量濃度碳源的TB培養基，培養方法如前所述，誘導后根據酶活力測定結果，選擇合適的碳源添加量。

1.3.4 重組大腸桿菌生長曲線的繪制

1.3.4.1 搖瓶條件下重組大腸桿菌生長曲線的繪制

取保藏于甘油管中的重組大腸桿菌50μL，接種于裝有30mL的Kana-LB液體培養基的250mL三角瓶中，37℃、200r/min培養10h，然后以5% 轉接量轉接于若干裝有50mL的Kana-TB液體培養基的250mL三角瓶中，37℃、200r/min振蕩培養，定點取樣測OD600nm值。以時間為橫坐標做該重組菌的生長曲線以及比生長速率曲線。

1.3.4.2 7L發酵罐中重組大腸桿菌生長曲線的繪制

將二級種子以5%接種量接至含3L TB培養基的7L發酵罐中，溶氧水平偶聯攪拌轉速，使溶氧濃度保持在30%左右，pH值控制在7.2左右，培養溫度37℃，流加50%的甘油，在保證碳氮源充足的情況下，每隔1h取樣測定OD600nm，繪制重組菌在3L TB培養基內的生長曲線。此處TB培養基組分為：12g/L蛋白胨魚粉、24g/L酵母浸膏、30g/L甘油、0.1g/L卡那霉素。

1.3.5 TB-TH培養基條件下，添加IPTG對重組大腸桿菌進行誘導條件的初步優化

1.3.5.1 誘導溫度的優化

根據宿主大腸桿菌適宜生長的溫度范圍及實驗室條件，在37℃培養至6h，并添加IPTG至終濃度1.0mmol/L后分別在不同溫度條件下進行誘導表達。酶活力測定方法參照1.3.1節，根據實驗結果確定誘導溫度。

1.3.5.2 IPTG添加時間的優化

參考TB培養基重組大腸桿菌生長曲線，在接種后不同時間添加IPTG誘導，并誘導6h。取相同體積的菌體，用0.25mol/L 的Tris-HCl (pH7.2)緩沖液稀釋至相同OD600nm=2后進行超聲波破碎，以p-NPPC法測得的酶活力的大小為參考，來確定誘導劑添加時間，具體操作參照1.3.1節。

1.3.5.3 IPTG 濃度的優化

添加不同濃度梯度的IPTG進行誘導表達。酶活力測定方法參照1.3.1節，根據結果確定誘導劑濃度。

1.3.5.4 誘導時間的確定

在上述已優化的誘導條件下進行誘導，分別誘導不同的時間后取樣破碎，酶活力測定方法參照1.3.1節，以確定誘導時間。

1.3.5.5 卡那霉素添加量的優化

在上述已優化的誘導條件下進行誘導，分別添加不同質量濃度梯度的卡那霉素，誘導至1.3.6.1節所優化時間后，取樣破碎，酶活力測定方法參照1.3.1節，確定卡那霉素的添加質量濃度。

1.3.6 TB-TH培養基條件下，添加乳糖對重組大腸桿菌進行誘導條件的初步優化

1.3.6.1 乳糖添加時間的優化

參考TB培養基重組大腸桿菌生長曲線，在接種后不同時間添加乳糖誘導，并誘導12h。酶活測定方法參照1.3.1節，根據測定結果確定乳糖添加時間。

1.3.6.2 乳糖添加量的優化

分別添加不同質量濃度的乳糖進行誘導表達。酶活力測定方法參照1.3.1節，根據結果確定誘導劑質量濃度。

1.3.6.3 誘導時間的優化

在上述已優化的誘導條件下進行誘導，分別誘導不同的時間后取樣破碎，酶活力測定方法參照1.3.1節，根據測定結果以確定誘導時間。

1.3.6.4 甘氨酸添加量的優化

根據上述優化結果進行發酵誘導，在添加乳糖的同時添加不同質量濃度梯度的甘氨酸，誘導時間暫定為6h。誘導結束后分別收集發酵液上清和細胞，將收集到的細胞進行細胞破碎，用p-NPPC法分別測定發酵液上清和細胞破碎液上清的酶活力，根據測定結果確定甘氨酸添加量。若在TB培養基中，甘氨酸對重組菌產酶有促進作用，則繼續進行甘氨酸添加時間、甘氨酸添加后誘導時間的優化，反之，則不會再繼續優化。

1.3.7 7L發酵罐實驗

1.3.7.1 一級、二級種子的制備

一級種子制備參照1.3.3節。

取一級種子轉接，接種至250mL三角瓶(5%轉接量)含50mL的Kana-LB培養基中，37℃、200r/min培養6h后，得到二級種子。150mL的二級種子作為7L發酵罐所用種子。

1.3.7.2 誘導時間對重組菌產酶的影響

參照重組菌生長曲線，在重組菌對數期中前期流加20%的乳糖(終質量濃度初步定為20g/L)進行誘導，誘導溫度為25℃，每隔6h左右取樣，測定OD600nm和酶活力。

2 結果與分析

2.1 TB培養基發酵實驗

發酵培養基的成分會影響重組大腸桿菌細胞的生長和產物的合成，與LB培養基比較：1) TB培養基營養豐富，成分組成更適合菌體生長，可獲得更多的菌體來生產重組酶；2) TB培養基含有緩沖體系，有較強的pH值緩沖能力，使pH值維持在7.0左右，有利于重組大腸桿菌的生長和重組酶的穩定；3) TB培養基酵母膏含量明顯高于LB等其他培養基，文獻報道酵母膏對重組大腸桿菌將重組酶釋放到細胞的周知空間有明顯的促進作用[14]。因此，本研究擬采用TB培養基代替LB培養基進行研究。

表 1 發酵培養基的比較Table 1 Comparison of different fermentation media on cell density and PLC activity

由表1可知，LB培養基的產酶量明顯高于TB培養基，因此先選擇LB培養基作為發酵培養基來進行搖瓶發酵優化。分析原因，可能是TB培養基中的高濃度磷酸鹽對磷脂酶C表達具有抑制作用[14-17]。因此擬將替換TB培養基中的緩沖液。在考慮緩沖液緩沖范圍及磷脂酶C和菌體的pH值耐受范圍的情況下，分別考察磷酸鹽、Tris-HCl、HEPES和無緩沖液4種情況對菌體生長和產酶的影響，方法參照1.3.2節。

由圖1可知，磷酸鹽、Tris-HCl的緩沖能力較好，發酵液的OD600nm可以達到12左右，而添加有HEPES的發酵液的OD600nm只有5左右，無緩沖液的情況下OD600nm只有4.5左右。誘導時間相同的情況下，緩沖液為為Tris-HCl時，酶活力可以達到260U/mL左右；緩沖液為磷酸鹽緩沖液時，酶活力可達160U/mL左右；緩沖液位HEPES時，酶活力可達200U/mL左右；無緩沖液時，酶活力可達180U/mL左右，由此可見Tris-HCl緩沖液要明顯好于其他3種情況。所以初步選擇Tris-HCl作為TB培養基的緩沖液，并將新培養基命名為TB-TH培養基。

圖 1 TB培養基中緩沖液的選擇Fig.1 Choice of optimum buffer in TB medium

2.2 TB-TH培養基中碳源的優化

圖 2 TB-TH培養基中碳源的選擇Fig.2 Choice of optimum carbon source in TB medium

由圖2可知，按產酶量從高到低排序，乳糖＞甘油＞葡萄糖＞可溶性淀粉＞殼聚糖＞麥芽糖＞蔗糖＞糊精。對含有Lac啟動子的重組菌，由于葡萄糖降低了胞內cAMP水平和減弱了誘導物的利用率，因此對其產酶有抑制作用[18]，與結果相符，因此葡萄糖雖是常見的碳源，適合菌體的生長，但酶活力并不高；乳糖本身即可作為碳源又是誘導劑，因此酶活力最高，但是乳糖作為碳源會增加發酵成本，綜合考慮后仍然選用甘油作為碳源。

2.3 TB-TH培養基中甘油質量濃度的優化

圖 3 TB-TH培養基中甘油質量濃度的優化Fig.3 Choice of optimum glycerin concentration in TB medium

由圖3可知，當甘油質量濃度為5g/L時，菌體產酶量最高，可達到260U/mL左右，因此甘油的初始質量濃度控制在5g/L 左右。綜上所述，最終TB-TH的組分為：12g/L 蛋白胨、24g/L酵母提取物、5g/L甘油，Tris-HCl(0.25mol/L，pH 7.2～7.4)緩沖液配制。

TB-TH培養基作為搖瓶發酵優化的培養基，以期找到產酶量最優的培養基和培養條件。最后在7L發酵罐中進行了工藝放大實驗，以驗證是否適合工業化生產。

2.4 搖瓶條件下重組菌生長曲線和比生長速率曲線的繪制

圖 4 搖瓶條件下重組菌生長曲線Fig.4 Growth curve of the recombination strain under shake f lask conditions

圖 5 搖瓶條件下重組菌比生長速率曲線Fig.5 Specif ic growth rate curve of the recombination strain under shake f lask conditions

由圖4、5可知，0～1.5h為適應期，1.5～24h為對數生長期，6h左右為對數中期。

2.5 TB-TH培養基中，添加IPTG對重組大腸桿菌進行誘導條件的初步優化

2.5.1 添加IPTG時誘導溫度對產酶的影響

圖 6 添加IPTG時誘導溫度對產酶的影響Fig.6 Effect of IPTG induction temperature on phospholipase activity

由圖6可知，誘導溫度為25℃時，重組蛋白的酶活力達到最大，可達到280U/mL左右。故選取發酵誘導的溫度為25℃。

圖 7 IPTG添加時間對產酶的影響Fig.7 Effect of IPTG addition time on phospholipase activity

2.5.2 IPTG添加時間對產酶的影響由圖7可知，在對數中期6h時添加IPTG，重組菌產酶量達到最大值，達到365U/mL左右。故IPTG添加時間為轉接后6 h。

2.5.3 IPTG濃度對酶活力的影響

圖 8 IPTG濃度對酶活力的影響Fig.8 Effect of IPTG concentration on phospholipase activity

由圖8可知，在IPTG濃度為0.6mmol/L時，重組菌產酶量達到最大，約485U/mL。故IPTG濃度選為0.6mmol/L。

2.5.4 添加IPTG時誘導時間對產酶的影響

圖 9 添加IPTG時誘導時間對產酶的影響Fig.9 Effect of IPTG induction time on phospholipase activity

由圖9可知，IPTG添加后20h，重組蛋白的酶活力達到最大值，可達到800U/mL左右。故誘導時間選為20h。

2.5.5 添加IPTG時卡那霉素質量濃度對酶活力的影響

由圖10可知，在卡那霉素質量濃度為0.15mg/mL時，重組菌產酶量達到最大，約850U/mL。故IPTG質量濃度選為0.15mg/mL。

圖 10 添加IPTG時卡那霉素添加量對酶活力的影響Fig.10 Effect of Kana concentration (when IPTG was added) on phospholipase activity

綜上所述，TB-TH培養基下，添加IPTG時，重組大腸桿菌誘導條件為：取保藏于甘油管中的重組大腸桿菌50μL加入到30mL的Kana-LB培養基中，于37℃、200r/min振蕩培養10h，次日以5%轉接量接種至50mL的TB-TH培養基中，添加卡那霉素的質量濃度為0.15mg/mL，37℃、200r/min培養6h后，添加IPTG至終濃度為0.6mmol/L，并25℃、150r/min誘導培養20h。在此誘導條件下，酶活力可達到(794.01±24.84)U/mL。

2.6 TB-TH培養基中，添加乳糖對重組大腸桿菌進行誘導條件的初步優化

圖 11 乳糖添加時間對酶活力的影響Fig.11 Effect of lactose addion time on phospholipase activity

2.6.1 乳糖添加時間的確定由圖11可知，在對數中期6h時添加乳糖，重組菌產酶量達到最大值，達到860U/mL左右。故乳糖添加時間為轉接后6h。

2.6.2 乳糖添加量對酶活力的影響

圖 12 乳糖質量濃度對酶活力的影響Fig.12 Effect of lactose concentration on phospholipase activity

由圖12可知，在乳糖質量濃度為5g/L時，重組菌產酶量達到最大，約1350U/mL。故乳糖質量濃度選為5g/L。

2.6.3 添加乳糖時誘導時間對產酶的影響

圖 13 添加乳糖時誘導時間對產酶的影響Fig.13 Effect of lactose induction time on phospholipase activity

由圖13可知，乳糖添加后22h，重組蛋白的酶活力達到最大值，可達到1422U/mL左右。故誘導時間選為22 h。

綜上所述，TB-TH培養基下，添加乳糖時，重組大腸桿菌誘導條件為：取保藏于甘油管中的重組大腸桿菌50μL加入到30mL的Kana-LB培養基中，于37℃、200r/min振蕩培養10h，次日以5%轉接量接種至50mL的TB-TH培養基中，添加Kana質量濃度至0.15mg/mL，37℃、200r/min培養6h后，添加乳糖至終質量濃度為5g/L，并25℃、150r/min誘導培養20h。在此誘導條件下，酶活力可達到(1422.42±37.17)U/mL。

2.6.4 甘氨酸質量濃度對酶活力的影響

雖然甘氨酸在很多大腸桿菌產重組酶的發酵過程中具有促進重組酶分泌的作用[19-20]，由圖14可知，在TB-TH培養基中添加甘氨酸對重組菌酶活的提高無任何促進作用，反而有顯著的抑制作用，因此，本研究不再對其進行進一步研究。參考有關文獻[14]可得，某些滲透性物質(例如甘氨酸)可對磷脂酶C的生產有抑制作用，這也較好的解釋了上述現象。

圖 14 甘氨酸添加量對酶活力的影響Fig.14 Effect of glycine concentration on phospholipase activity

2.7 7L分批發酵實驗

2.7.1 重組菌在7L發酵罐種生長曲線的繪制

圖 15 在發酵罐中不流加甘油時，重組菌生長曲線Fig.15 Growth curve of the recombination strain without the addition of glycerol in fermentation tanks

圖15為不流加50%甘油時的生長曲線，重組菌在1h后進入對數生長期，8h左右進入穩定期，對比搖瓶發酵下的生長曲線(圖4)可知，重組菌的生長周期比搖瓶發酵下大大縮短。在pH值和溶氧都得到較好控制的情況下，發酵的OD600nm值最高可以達到12左右，與搖瓶發酵下基本一致。

圖 16 在發酵罐中流加甘油時，重組菌生長曲線Fig.16 Growth curve of the recombination strain with the addition of glycerol in fermentation tanks

圖16為流加50%甘油時的生長曲線，重組菌在3h后進入對數生長期，24h左右進入穩定期。在碳氮源充足、pH值和溶氧都得到較好控制的情況下，發酵的OD600nm值最高可以達到70左右，比搖瓶發酵下提高了5倍左右。

綜上所述，最終選擇了流加甘油的方式進行后續乳糖誘導實驗。

2.7.2 誘導時間對產酶的影響

圖 17 發酵罐中誘導時間對產酶的影響Fig.17 Inf luence of induction time on phospholipase production in fermentation tanks

乳糖的添加時間為發酵后6h，即OD600nm為20左右時。由圖17可知，胞內酶活在加入誘導劑后2h便迅速增加，在14～34h左右酶活力增長趨于平緩，在62h左右酶活力達到最高，最高為(10957.97±58.03)U/mL；胞外酶活在加入誘導劑后25h左右迅速增加，在45h左右達到最高，最高為(645.27±13.87)U/mL；總酶活力在62h左右達到最高，達到(11583.35±70.21)U/mL，比搖瓶發酵下提高了7倍左右。

由于是在25℃誘導，因此菌體的生長速度明顯不如在37℃培養時，且生長周期大大延長，OD600nm最大值為66左右。在14～34h左右時，酶活力增加不明顯，但是菌體量增長迅速，原因可能是菌體此段時間主要進行分裂生長，即甘油的利用率遠遠大于乳糖的利用率，致使乳糖的誘導效率明顯降低。

與LB培養基相比，利用TB培養基在7L發酵罐中發酵時，重組菌的酶活力提升幅度較理想，因此，如果將重組大腸桿菌BL21(DE3)/pET28a-plcH應用于工業化生產，TB (無緩沖液)培養基是較理想的培養介質。

3 討 論

利用TB-TH培養基，對E. coli BL21(DE3)/pET28a-plcH進行了搖瓶發酵條件的優化。誘導劑為IPTG的情況下，確定的最優產酶條件為：5%轉接量，250mL三角瓶裝液量為50mL，卡那霉素的質量濃度150μg/mL，37℃、200r/min培養6h時添加IPTG至終濃度為0.6 mmol/L，25℃、150r/min誘導培養20h，酶活力可達到(794.01±24.84)U/mL；誘導劑為乳糖的情況下，確定的最優產酶條件為：5%轉接量，250mL三角瓶裝液量為50mL，卡那霉素的質量濃度150μg/mL，37℃、200r/min培養6h時添加乳糖至終質量濃度為5g/L，25℃、150r/min誘導培養22h，酶活力可達到(1422.42±37.17)U/mL，較IPTG誘導條件下提高了0.8倍。

進一步考察了添加甘氨酸對E. coli BL21(DE3)/pET28a-plcH產酶的影響。結果顯示，在TB-TH培養基中添加甘氨酸對重組菌產酶量的提高無任何促進作用，反而有顯著的抑制作用，一定程度上證實了相關文獻報道，即某些滲透性物質(例如甘氨酸)可對磷脂酶C的生產有抑制作用[14]，這也較好的解釋了上述現象。

在7L發酵罐中對E. coli BL21(DE3)/pET28a-plcH進行發酵條件的優化。在加入乳糖后2h胞內酶活力便迅速增加，在14～34h左右酶活力增長趨于平緩，在62h左右酶活力達到最高，最高為(10957.97±58.03)U/mL；胞外酶活在加入乳糖后25h左右迅速增加，在45h左右達到最高，最高為(645.27±13.87)U/mL；總酶活力在62h左右達到最高，達到(11583.35±70.21)U/mL，比搖瓶發酵下提高了7倍左右。

P. aeruginosa含有多個與編碼磷脂酶C有關的基因，基于課題組前期研究，選擇重組表達具有溶血活性的plcH的大腸桿菌BL21 (DE3)/pET28a-plcH在實驗室規模進行發酵條件的優化，并在7L發酵罐中進行了工藝驗證，獲得了(11583.35±70.21)U/mL的高酶活力，為下一步研究磷脂酶C的產業化奠定了較好的基礎。

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