雞肉酶解工藝對熱反應雞肉香精香氣的影響

陳海濤，徐曉蘭，張 寧，孫寶國，王 鶴

(北京工商大學食品學院，北京市食品風味化學重點實驗室，北京 100048)

肉味香精是一種能賦予肉制品良好風味的食用香精，近些年來發展迅速，已廣泛應用于方便面、膨化休閑食品及熟肉制品的調香、呈味。傳統的肉味香精主要是利用各種合成的單體香料經過調香生產而成，很難達到與熟肉香味逼真的水平，香味單薄、口感較差[1]，所以對天然熱反應肉味香精的研究引起了人們的高度重視。其主要是利用蛋白酶將肉類酶解為多肽和游離氨基酸等前體反應物，再通過添加還原糖、氨基酸、油脂等熱反應原料，在有控制的條件下加熱反應，產生大量的揮發性肉類香氣物質，香氣濃郁逼真、強度大[2-3]。但由于不同種類蛋白酶的作用特性和酶解條件的差異，所得的氨基酸和多肽的種類和數量也會不同，使得參與熱反應的前體物質不同，從而直接影響到最終熱反應香精的風味和強度[4]，因此對肉類蛋白酶解的研究具有重要的意義。

本實驗以雞胸肉為原料，選用動物蛋白酶、木瓜蛋白酶、風味蛋白酶、復合蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶，研究不同的酶解條件對水解度和所制備的雞肉香精風味的影響，通過對酶解液參與熱反應所得產物的感官評價，確定最優酶解工藝條件，為具有雞肉香氣特征的熱反應香精的生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞胸肉 市售。

甲醛(分析純) 成都長聯化工試劑有限公司；動物蛋白酶(30萬U/g)、木瓜蛋白酶(200萬U/g)均為食品級 南寧龐博生物工程有限公司；風味蛋白酶(500 LAPU/g)、復合蛋白酶(1.5AU/g) 丹麥諾維信公司；葡萄糖、VB1、L-半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸 冀州市華陽化工有限責任公司；植物水解蛋白(hydrolyzed vegetable protein，HVP) 河北省保定味群食品工業有限公司；雞油 北京華都肉雞有限責任公司。

1.2 儀器與設備

PHSJ-4A型pH計 上海雷磁儀器廠；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器、ZNHW-Ⅱ型智能恒溫電熱套 鞏義市予華儀器有限公司；KXH101-2A 型恒溫干燥箱 上海錦屏儀器儀表有限公司；高速離心機 深圳天南海北實業有限公司。

1.3 方法

1.3.1 水解度測定方法[5-6]

采用甲醛電位滴定法測定上清液氨基態氮含量，凱式定氮法測定總氮含量，按照下式計算水解度。

式中：N0為總氮含量/%；N1為酶解前游離氨基態氮含量/%；N2為酶解后游離氨基態氮含量/%。

1.3.2 熱反應香精制備方法

雞肉酶解液100g、葡萄糖8.1g、VB15.055g、半胱氨酸1.815g、甘氨酸0.374g、丙氨酸0.891g、HVP 6g、雞油3g，置于250mL四口燒瓶中，在300r/min、100℃條件下反應90min。反應結束后，將產物移出，冷卻。將熱反應香精靜置1d后，參照表1進行感官評價，考察各因素對終產物香氣的影響。

表 1 雞肉香精香氣評價標準Table 1 Criteria for sensory evaluation of chicken flavoring

1.3.3 感官評價方法

由3名專業調香人員、4名肉味香精熱反應專業人員和3名肉味香精應用專業人員對樣品風味進行感官評價，評價標準如表1所示，滿分為100分，最后取10人的平均分作為最終結果。

1.4 雞肉酶解工藝條件的實驗設計

1.4.1 雞肉酶解工藝流程

雞胸肉泥→加水勻漿→保溫酶解一定時間→100℃滅酶10min→冷卻→酶解液

1.4.2 預處理溫度的選擇酶解前，先對底物進行水浴加熱30min，水浴溫度分別為60、70、80、90、100℃，然后進行酶解，以未經預處理的雞肉液為對照組，固定酶解條件：動物蛋白酶、加酶量1.100‰、底物質量比(肉和水質量比)1：1、溫度50℃，自然pH值條件下酶解2h。做3次平行，找到最佳加熱預處理溫度。

1.4.3 單一蛋白酶酶解的選擇

分別采用動物蛋白酶、木瓜蛋白酶、風味蛋白酶和復合蛋白酶在其各自的最適溫度下，統一底物質量比1：1、加酶量1.100‰，自然pH值條件下酶解2h，測定酶解產物的水解度及酶解液參與熱反應所得香精的感官評價結果。做3次平行，確定最佳單一蛋白酶。

1.4.4 蛋白酶復配酶解的選擇

1.4.4.1 最佳復配酶的選擇

將動物蛋白酶和其他3種蛋白酶復配對雞胸肉進行酶解，每種酶的用量均為0.550‰，底物質量比1：1、酶解溫度50℃，自然pH值條件下酶解2h，測定酶解產物的水解度及酶解液參與熱反應所得香精的感官評價結果。做3次平行，確定和動物蛋白酶復配的最佳酶種類。

1.4.4.2 酶配比的選擇

酶解固定條件為底物質量比1：1、酶解溫度50℃、總加酶量1.100‰，自然pH值條件下酶解2h。動物蛋白酶和上述選出的另一種酶的復配比(質量比)分別為3：1、2：1、1：1、1：2、1：3不同水平，測定酶解產物的水解度及酶解液參與熱反應所得香精的感官評價結果。做3次平行，確定2種酶的最佳復配比。

1.4.4.3 總加酶量的選擇

酶解固定條件為底物質量比1：1、溫度50℃，酶配比為上述選出的值，自然pH值條件下酶解2h。總加酶量選擇0.275‰、0.550‰、1.100‰、1.650‰、2.200‰不同水平，測定酶解產物的水解度及酶解液參與熱反應所得香精的感官評價結果。做3次平行，確定最佳總加酶量。

1.4.4.4 底物質量比的選擇

酶解固定條件為溫度50℃，酶配比和總加酶量為上述選出的值，自然pH值條件下酶解2h。底物質量比選擇1：2、1：1、2：1不同水平，測定酶解產物的水解度及酶解液參與熱反應所得香精的感官評價結果。做3次平行，確定最佳底物質量比。

1.4.4.5 酶解溫度的選擇

固定上述選出的最佳底物質量比、酶配比、總加酶量，自然pH值條件下酶解2h。酶解溫度選擇45、50、55、60℃不同水平，測定酶解產物的水解度及酶解液參與熱反應所得香精的感官評價結果。做3次平行，確定最佳酶解溫度。

1.4.4.6 酶解時間的選擇

固定上述選出的最佳底物質量比、酶配比、總加酶量。酶解時間選擇1、2、3、4h不同水平，測定酶解產物的水解度及酶解液參與熱反應所得香精的感官評價結果。做3次平行，確定最佳酶解時間。

1.4.4.7 加酶方式的選擇

多酶酶解時有同步水解(酶同時加入)和分步水解(酶分先后加入)兩種方式[7]。固定反應體系的底物質量比、加酶量、酶配比和溫度，同步水解時，將兩種酶共同加入反應體系進行水解一定時間；分步水解時，先加一種酶反應一段時間后，選擇滅酶或不滅酶后，再加入另一種酶共同水解。

1.4.5 正交試驗優化酶解工藝條件[8]

通過單因素試驗的結果，選擇L9(34)正交表對酶解反應時間、加酶方式、底物質量比以及總加酶量4個因素進行正交優化。因素及水平選取如表2所示。

表 2 蛋白酶酶解正交試驗因素水平表Table 2 Coded value and corresponding actual values of the hydrolysis parameters used in the orthogonal array design

2 結果與分析

2.1 預處理溫度的確定

圖 1 預處理溫度對水解度的影響Fig.1 Effect of pretreatment temperature on DH of chicken

由圖1可知，經過熱處理后，水解度不但沒有增加反而降低了，這可能是由于熱變性溫度過高或時間過長，導致蛋白質過度聚合，生成分子締合物，造成蛋白質過度熱變性，從而降低水解度[9]。所以，本實驗不采用加熱預處理。

2.2 單一蛋白酶酶解的選擇

肉香味形成的主要原理是氨基酸和各種羰基化合物之間的“羰氨反應”，即美拉德反應[10]，因此氨基酸的組成對美拉德反應產物的香氣影響很大。但由于各種蛋白酶的作用位點不同，酶解所得的多肽和氨基酸的種類和含量也會不同[11]，因此蛋白酶的選擇對于香精香氣的形成非常重要。

表 3 單一酶對水解度及產物香氣的影響Table 3 Effect of different proteases, when used singly, on sensory aroma score of chicken flavoring

由表3可知，相同酶解時間下，木瓜蛋白酶酶解產物的水解度最大，其次是中性蛋白酶，再次是動物蛋白酶，而風味蛋白酶酶解產物的水解度最小，這可能與木瓜蛋白酶的內切酶特性和風味酶的外切酶特性有關，內切酶可以直接作用于蛋白質肽鏈的中間位點，而外切酶只有從蛋白質肽鏈的兩端酶解，由于缺乏足夠多的端點，風味酶酶解產物的水解度較低[12-13]。但是從酶解液參與熱反應的實驗上看，動物蛋白酶的酶解液參與熱反應得分最高、香氣最佳，而木瓜蛋白酶有生腥味，香氣不協調。因此，綜合考慮，選定動物蛋白酶為最佳單酶。但從整體上說，經單酶酶解的所有熱反應產物的肉香都不夠突出，逼真性不好，可能是由于單酶酶解的位點比較單一，不利于熱反應底物短肽及氨基酸的形成，因此，考慮將動物蛋白酶和其他3種單酶進行復配酶解。

2.3 蛋白酶復配酶解的選擇

2.3.1 最佳復配酶的選擇

表 4 復配酶的種類對水解度及產物香氣的影響Table 4 Effect of comblnations of anima-derived protease with another protease on sensory aroma score of chicken flavoring

將表4和表3對比發現，雙酶復配酶解比單一酶酶解的效果好。首先，水解度方面有了較明顯的提高，說明雙酶復配后使酶切位點增多，更加有利于雞肉的酶解。另外，利用雙酶復配制備的酶解液參與熱反應得到的產物香氣明顯優于單酶酶解，尤其是動物蛋白酶和復合蛋白酶復配時，所得產物肉味突出且特征香味明顯。因此，選擇動物蛋白酶和復合蛋白酶作為復配的2種蛋白酶。

2.3.2 酶配比的選擇

由圖2可知，水解度方面，隨著動物蛋白酶含量的減少，水解度曲線先下降后上升，上升到一定程度又下降，當動物蛋白酶與復合蛋白酶的復配比為1：2時水解效果最好，1：1時次之；在香氣評價方面，在酶配比為1：1時，所得最終熱反應產物肉感飽滿且香氣濃郁，得分最高，而1：2時的最終熱反應產物雖有一定的肉香味，但雞肉特征香氣不明顯，在酶配比為3：1時，所得最終產物有肉腥味，2：1和1：3時有異味，得分低。綜合考慮，選擇動物蛋白酶和復合蛋白酶的酶配比為1：1。

圖 2 酶配比對水解度及產物香氣的影響Fig.2 Effect of animal-derived protease/protamex ratio on DH of chicken and sensory aroma score of chicken fl avoring

2.3.3 總加酶量的選擇

圖 3 總加酶量對水解度及產物香氣的影響Fig.3 Effect of total enzyme dosage on DH of chicken and sensory aroma score of chicken fl avoring

由圖3可知，隨著總加酶量的增加，水解度越來越大，這可能是由于加酶量處于0.275‰～2.200‰范圍內時，增加的酶量相對于底物質量比來說并未飽和，隨著加酶量的增大，反應速度越來越快，蛋白質水解率也越來越高[14-15]。但從熱反應產物香氣評分上看，當加酶量由0.275‰增加到0.550‰時，香氣得分呈上升趨勢，但加酶量超過0.550‰后，隨著酶量的增加香氣得分反而逐漸下降，其中，加酶量為0.550‰時有濃郁的肉香和脂香且香氣協調度好，加酶量為1.650‰時出現了輕微的糊味而影響了整體的協調度，加酶量為2.200‰時則出現了較明顯的苦味，這可能與水解出一定量的苦味肽有關。綜合考慮，選擇總加酶量為0.550‰。

2.3.4 底物質量比的選擇

圖 4 底物質量比對水解度及產物香氣的影響Fig.4 Effect of substrate/water ratio on DH of chicken and sensory aroma score of chicken fl avoring

由圖4可知，隨著底物中肉含量的增加，水解度呈增長趨勢，這說明在酶量固定的情況下，在一定范圍內，隨著肉含量的增加，可水解的蛋白質底物增多，水解度不斷上升。從熱反應產物香氣評分上看，肉水質量比為1：1時香氣評分最高，所得的產物香氣濃郁，給人愉悅的感覺，而1：2時有雞湯味，但稍有腥味，2：1時肉香較好，但留香時間短。綜合考慮，選擇底物質量比為1：1。

2.3.5 酶解溫度的選擇

圖 5 酶解溫度對水解度及產物香氣的影響Fig.5 Effect of hydrolysis temperature on DH of chicken and sensory aroma score of chicken fl avoring

在蛋白質酶解反應中，溫度是重要參數之一。它從兩個方面影響酶解反應的效率[16]：1)影響蛋白酶催化反應的速度；2)影響蛋白酶的穩定性。由圖5可知，當溫度在45～50℃范圍內時，水解度和香氣評分都呈現上升趨勢，而在50～60℃范圍內時，水解度和香氣評分都呈現相似的下降趨勢，說明溫度超過一定值后，酶活力會很快喪失，蛋白質的穩定性下降，從而導致水解度的下降，故此酶解的溫度選為50℃。

2.3.6 酶解時間的選擇

圖 6 酶解時間對水解度及產物香氣的影響Fig.6 Effect of hydrolysis time on DH of chicken and sensory aroma score of chicken fl avoring

由圖6可知，酶解時間在1～3h內，水解度的增速很快，3～4h內增速趨于平緩。從熱反應產物香氣評分上看，1～3h內香氣越來越濃郁，特征香越來越明顯，而3～4h內香氣質量開始下降，這可能是由于反應時間過長，美拉德反應產生一些短肽類的苦味物質[17-20]。綜合考慮將酶解時間定在3h為宜。

2.3.7 加酶方式的考察

表 5 加酶方式對水解度及產物香氣的影響Table 5 Effect of different modes of enzymatic hydrolysis on DH of chicken and sensory aroma score of chicken flavoring

由表5可知，不同的加酶方式對酶解產物的水解度和酶解物參與熱反應的效果都產生了較大的影響，其中，先加復合蛋白酶50℃酶解1.5h后，不滅酶，再加入動物蛋白酶50℃酶解1.5h條件下制備的酶解液的水解度較高，而且制備的熱反應產物雞肉香味飽滿、圓潤，逼真性好，因此，選定該加酶方式。

2.4 正交試驗優化酶解工藝條件

表 6 蛋白酶酶解正交試驗結果Table 6 Orthogonal array design matrix with sensory aroma score of chicken flavoring

由表6可知，對正交試驗結果進行極差分析可得，極差大小順序為RC＞RA＞RB＞RD，所以各因素從主到次的順序為：C(底物質量比)＞A(酶解溫度)＞B(加酶方式)＞D(總加酶量)，最優方案為C3A2B1D3，即底物質量比為1：1、酶解溫度50℃、加酶方式1h：2h(復合蛋白酶酶解1h后，不滅酶，加入動物蛋白酶再酶解2h)、總加酶量1.100‰。在此酶解條件下進行驗證實驗，得到雞肉蛋白的水解度為20.47%，所得的酶解液參與熱反應制備的雞肉香精肉感飽滿、香氣突出、留香時間長、整體協調度好，香氣評分95分。

3 結 論

3.1 雞肉酶解時酶的選擇對于熱反應香精的香氣有很重要的影響，利用動物蛋白酶和復合蛋白酶進行復配酶解，所得的酶解液參與熱反應制備的產物香氣較好。

3.2 通過單因素試驗，對影響酶解過程的多個因素進行研究，初步得出酶解工藝各因素的適宜條件，然后在此基礎上進行正交優化，得出對熱反應雞肉香精香氣影響較大的4個因素的主次關系是：底物質量比＞酶解溫度＞加酶方式＞總加酶量。

3.3 正交得到最優的酶解條件為：底物質量比為1：1、酶解溫度50℃、加酶方式1h：2h(復合蛋白酶酶解1h后加入動物蛋白酶共同酶解2h)、總加酶量1.100‰，此時的水解度可達20.47%，制備的雞肉香精肉香突出，仿真度高。

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