醋酸纖維素-聚丙烯復合膜固定化轉谷氨酰胺酶的研究

時 敏，王 雪，馬麗娜，于殿宇

(東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030)

蛋白質-谷氨酰胺γ-谷氨酰胺基轉移酶(MTG，EC2.3.2.13，簡稱轉谷氨酰胺酶)是一種能催化轉?；磻呋鞍踪|中的賴氨酸上的ε-氨基和谷氨酸上的γ-羥酰胺基之間的結合反應，從而導致蛋白質(或多肽)之間發生共價交聯形成共價化合物的聚合酶[1]。它可通過胺的導入、交聯以及脫胺3種途徑改善蛋白質的功能特性[2-3]。這種酶不僅可以改善食品的功能特性，通過交聯作用還可以開發新的具有更高營養特性的新食品資源[4-7]，因此在食品類生產中有著廣泛的應用。而轉谷氨酰胺酶的穩定性較差，在常態條件下易失活[8]。文獻[9-11]采用將酶制成酶晶體，用磁性殼聚糖固定等方法提高酶的穩定性、延長貯藏期，并提高其重復使用率。雖然對聚丙烯膜進行處理的方法有很多種[12-13]，但是將其表面涂層醋酸纖維素固定轉谷氨酰胺酶卻未見報道。以高分子分離膜作為載體的固定化酶膜能夠將酶的催化特性和膜的優良分離性能進行有機地結合，成為了近年來的研究熱點[14-16]。

醋酸纖維素-聚丙烯復合膜具有一定的吸附性、化學穩定性、疏水性和機械性能優良等優點，用其固定化酶可提高酶在反應體系中的活性和穩定性，從而有利于酶的回收和產品的生產。本實驗利用醋酸纖維素-聚丙烯復合膜為載體固定轉谷氨酰胺酶，研究不同固定化條件對固定化效率和催化效果的影響，并對固定化轉谷氨酰胺酶酶學性質進行探討。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

醋酸纖維素 北京惠寶聯化科技有限公司；聚丙烯膜 北京塑料研究所；轉谷氨酰胺酶 上海線磊生物科技有限公司。

丙酮 天津市基準化學試劑有限公司；磷酸氫二鈉天津基準化學試劑有限公司；N-α-CBZ-Gln-Gly 上海竹源生物科技有限公司 ；三氯乙酸、FeCl3·6H2O 蘇州源景化工有限公司；L-谷氨酸γ-單羥肟酸 深圳市迪肯科技有限公司。

1.2 儀器與設備

UV-260紫外分光光度計 上海元析儀器有限公司；高速離心機 北京醫藥公司；DF-101S焦熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鄭州金育科貿有限公司；PHS-3C精密酸度計 瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 醋酸纖維素-聚丙烯復合膜的制備

將5g醋酸纖維素溶于100mL丙酮中，待溶解完全成均一的膜液后，取聚丙烯膜浸于溶有醋酸纖維素的丙酮溶液中，自然成膜，以去離子水沖洗醋酸纖維素-聚丙烯復合膜數次干燥備用[17]。

1.3.2 轉谷氨酰胺酶的固定

采用吸附、交聯相結合的固定化方法，取若干1cm2的醋酸纖維素-聚丙烯復合膜于三角瓶中，加入一定質量濃度的轉谷氨酰胺酶液和pH6.0的磷酸鹽緩沖液中，吸附一定時間。再加入一定量戊二醛進行交聯反應，反應結束后將膜取出，用磷酸鹽緩沖溶液沖洗后干燥。并將干燥好的固定化酶膜浸入磷酸鹽緩沖液中貯存備用。

1.3.3 酶活力測定

采用Folk等[18]的分光異羥肟酸(hydroxamate)分析法測定。1個酶活力單位定義為：37℃時每分鐘催化1μmol N-α-CBZ-Gln-Gly生成單羥肟酸的酶量，單位是U/g膜。相對酶活力以每組中所測酶活力與該組中最高酶活力的相對百分比表示。

1.3.4 固定化轉谷氨酰胺酶酶學性質

固定化轉谷氨酰胺酶酶學性質包括對固定化酶的最適溫度和最適pH值[19]。

1.3.5 電鏡掃描(SEM)

將聚丙烯膜、醋酸纖維素-聚丙烯復合膜及在相同條件下，聚丙烯膜固定的轉谷氨酰胺酶膜和醋酸纖維素-聚丙烯復合膜固定的轉谷氨酰胺酶膜進行電鏡掃描。

2 結果與分析

2.1 酶液質量濃度對固定化效果的影響

圖 1 酶液質量濃度對固定化酶膜酶活力的影響Fig.1 Effect of enzyme concentration on the activity of immobilized enzyme membrane

在吸附時間4h、戊二醛添加量0.3g/100mL、戊二醛交聯時間4h的條件下，分別考察酶液質量濃度為5、10、15、20、25mg/mL對固定化酶活力的影響。由圖1可知，酶活力隨著酶液質量濃度的增加而增大，在15mg/mL時達到最大值，隨后隨著酶液質量濃度的增加而緩慢降低。說明醋酸纖維素-聚丙烯復合膜作為載體固定化轉谷氨酰胺酶的量是有限的，酶液質量濃度達到一定量后，醋酸纖維素-聚丙烯復合膜吸附的轉谷氨酰胺酶相互聚集，從而使酶活力降低。

2.2 吸附時間對固定化效果的影響

圖 2 吸附時間對固定化酶膜酶活力的影響Fig.2 Effect of adsorption time on the activity of immobilized enzyme membrane

在酶液質量濃度15mg/mL、戊二醛添加量0.3g/100mL、戊二醛交聯時間4h的條件下，考察吸附時間為1、2、3、4、5h對固定化酶活力的影響。由圖2可知，酶活力隨著吸附時間的延長而增大，在3h達到最大值，隨后隨著吸附時間的進一步延長而降低。說明酶分子與載體反應基團可相互結合，尤其在3h最為充分，此后酶分子相互聚集導致酶的活性中心互相遮蓋而使酶活力逐漸降低。

2.3 戊二醛添加量對固定化效果的影響

在酶液質量濃度15mg/mL、吸附時間3h、戊二醛交聯時間4h的條件下，采用戊二醛添加量為0.、0.2、0.3、0.4、0.5g/100mL對固定化磷脂酶活力的影響。由圖3可知，固定化酶活隨著戊二醛添加量的增加而增加，在0.3g/100mL時固定效果最好，之后則隨著添加量的進一步增加而降低。這是因為在反應開始時，轉谷氨酰胺酶被戊二醛充分交聯，隨后達到飽和，進一步增加戊二醛的添加量那么戊二醛對酶就會產生一定的抑制作用，從而導致酶活力降低。

圖 3 戊二醛添加量對固定化酶膜酶活力的影響Fig.3 Effect of glutaraldehyde concentration on the activity of immobilized enzyme membrane

2.4 戊二醛交聯時間對固定化效果的影響

圖 4 戊二醛交聯時間對固定化酶膜酶活力的影響Fig.4 Effect of cross-linking time on the activity of immobilized enzyme membrane

在酶液質量濃度15mg/mL、吸附時間3h、戊二醛添加量0.3g/100mL的條件下，考察戊二醛交聯時間為2、3、4、5、6h對固定化酶活力的影響。由圖4可知，轉谷氨酰胺酶的酶活力隨著戊二醛交聯時間的延長而增加，在4h時達到最大值，之后隨著交聯時間的進一步延長而減小。引起這一現象的原因可能是超過4h后時間過長，交聯程度過高，酶的活性中心被破壞，從而是的酶活力下降。

2.5 固定化酶膜最適pH值

圖 5 固定化酶膜與游離酶最適pH值Fig.5 Optimal pH of immobilized enzyme membrane and free enzyme

其他條件不變，分別在各自最適溫度條件下，在pH值為3～9范圍內測定固定化酶和游離酶活力，并計算相對酶活力。由圖5可知，在相同設定條件下，固定化酶膜最適pH值為5～6，游離酶最適pH值為6～7，這與Ando等[19]報道的轉谷氨酰胺酶的最適pH6～7相一致。說明酶經固定化以后對pH值的敏感性降低。還可以看出，固定化酶膜在偏酸性的環境中比在偏堿性的環境中相對酶活力降低的幅度要小，原因可能是固定在膜上的酶構象發生了變化，引起其對酸性環境的適應性增強。

2.6 固定化酶膜最適溫度

圖 6 固定化酶膜及游離酶的最適溫度Fig.6 Optimal temperature of immobilized enzyme membrane and free enzyme

其他條件不變，分別在各自最適pH值條件下，在溫度范圍30～60℃水浴鍋內測定固定化酶和游離酶活力，并計算相對酶活力。由圖6可知，在相同實驗設定條件下，游離酶最適溫度為35～40℃，當溫度超過40℃時相對酶活力顯著下降，而固定化酶最適溫度為45～50℃，當溫度超過50℃相對酶活力顯著下降。

2.7 電鏡掃描結果

圖 7 微孔膜及固定化酶的電鏡掃描圖Fig.7 Scanning electron microscopic images

圖7a中，膜呈纖維狀，錯亂交叉，排列不規則，但表面平整光滑。圖7b顯示，固定化后的膜的纖維表面附著一些顆粒或團狀的物體而顯得有些粗糙，但由于結構松散，膜上固定的酶容易脫落[20]。圖7c中，膜表面致密、均勻，利于轉谷氨酰胺酶的固定。圖7d中，膜表面大部分被酶覆蓋，且酶堆積的均勻，表明大部分酶固定在醋酸纖維素-聚丙烯復合膜的界面上，這種結構較利于轉谷氨酰胺酶的固定。

3 結 論

通過醋酸纖維素-聚丙烯復合膜對轉谷氨酰胺酶進行固定，進行單因素試驗確定最佳固定化條件為：酶液質量濃度15mg/mL、吸附時間3h、戊二醛添加量0.3g/100mL、戊二醛交聯時間4h。在最佳固定化條件下固定的酶活力可達16.1U/g膜。對固定化酶和游離酶的酶學性質進行比較，得出游離酶最適溫度為35～40℃，而固定化酶膜最適溫度為45～50℃；游離酶最適pH值為6～7，固定化酶膜最適pH值為5～6，固定化酶比游離酶向酸性偏移。SEM圖顯示醋酸纖維素-聚丙烯復合膜表面結構有利于轉谷氨酰胺酶的固定。

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