重組畢赤酵母葡萄糖氧化酶的純化和性質

郝杰清，王帥坤，師 慧，王振偉，孟延發*

(四川大學生命科學學院，生物資源與生態環境教育部重點實驗室，四川 成都 610064)

葡萄糖氧化酶(glucose oxidase，GOD，EC 1.1.3.4)是一種需氧脫氫酶，能夠在有氧條件下高度專一性的將β-D-葡萄糖氧化成葡萄糖酸和過氧化氫[1]。它廣泛分布于動物、植物和微生物體內。葡萄糖氧化酶在食品工業、醫療診斷、生物傳感器方面有著廣泛的應用[2-4]。目前應用于工業生產中的主要是青霉屬和黑曲霉兩種[5-6]。但這兩種菌在發酵生產過程中會產生大量的雜蛋白，較難純化。甲醇畢赤酵母是一類新的真核表達系統，它具有真核表達系統所共有的優點，而且表達產物分泌至胞外，雜蛋白少，易于純化[7-8]。本研究在已有重組畢赤酵母葡萄糖氧化酶基礎上，對其進行分離純化并對酶學性質進行研究，以期為其在食品工業和醫藥生產上的應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與培養基

重組Pichia pastoris GS115是用黑曲霉的葡萄糖氧化酶基因構建的基因工程酵母菌，由本實驗室保存。

種子培養基(g/L)：蛋白胨20、酵母膏10、葡萄糖20，自然pH值。發酵培養基(g/L)：蛋白胨20、酵母膏10，溶于100mmol/L pH6.0的磷酸鉀緩沖液中。均于121℃滅菌30min。

1.1.2 試劑與儀器

酵母膏、蛋白胨 英國Oxoid公司；過氧化物酶(POD) 日本Toyobo公司；牛血清白蛋白(BSA)、4-嗎啉乙磺酸(MES) 美國Sigma公司；4-氨基安替比林(4-AA) 上海靈錦精細化工有限公司；EHSPT 上海阿拉丁試劑有限公司；Q-Sepharose Fast Flow 美國Pharmacia公司；葡萄糖、無水甲醇等為國產分析純。

5804R冷凍高速離心機 德國Eppendorf公司；UV-2102紫外-可見分光光度計 美國Unico公司；Mini Ⅱ型電泳儀 美國Bio-Rad公司；Pellicon Biomax超濾器 美國Millipore公司；HD-2000紫外檢測儀 上海嘉鵬科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 粗酶液的制備

將在斜面培養基上(30℃)培養48h的畢赤酵母接入種子培養基中，30℃、200r/min振蕩培養24h至OD600nm約為2～6，種子液以5%的接種量接入300mL發酵培養基中，相同條件振蕩培養24h，以體積分數0.5%加入甲醇開始誘導，溫度調整為25℃，每24h后加入等量的甲醇連續誘導10d。將發酵液在4℃、10000r/min離心5min，收集上清液，即為粗酶液。

1.2.2 酶的分離純化

將粗酶液在冰浴條件下用Biomax 50kD超濾器濃縮至較小體積，用pH7.0 20mmol/L磷酸鉀緩沖液透析除鹽，上Q-Sepharose Fast Flow柱，以0～0.5mol/L NaCl，pH7.0 20mmol/L磷酸鉀緩沖液進行直線梯度洗脫，檢測并收集有酶活性部分。

1.2.3 蛋白質含量的測定

采用Bradford法[9]，以BSA為標準。

1.2.4 重組葡萄糖氧化酶酶活力的測定

取適當稀釋后酶液50μL，加入1.0mL 含有79mmol/L pH6.0 MES-Na，131mmol/L葡萄糖，0.2mmol/L 4-AA，0.3mmol/L EHSPT，4U/mL POD的底物反應液中，在40℃準確反應5min，再置于沸水浴中快速滅活30s，冷卻至室溫，在波長555nm處測定其吸光度；空白對照除酶液預先滅活，其他處理相同。在上述條件下，每分鐘催化生成1μmol/L H2O2所需的酶量定義為一個酶活力單位。

1.2.5 分子質量的測定

梯度PAGE[10]測定GOD全蛋白分子質量，濃縮膠4.0%、分離膠5.0%～15.0%；SDS-PAGE[10]測定GOD亞基分子質量，濃縮膠4.0%、分離膠10.0%，在還原和非還原條件下進行電泳；考馬斯亮藍R-250染色。

1.2.6 最適pH值和酸堿穩定性的分析

在40℃條件下測定GOD純酶在pH 3.0、4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、8.0時的酶活性，確定GOD的最適pH值。將酶液用0.2mol/L的不同pH值(3.0～12.0)的緩沖液進行適當稀釋，4℃處理24h后在40℃、pH6.0條件下測定剩余酶活力，考察酶的酸堿穩定性。

pH3.0～6.0為0.2mol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液；pH7.0～9.0為0.2mol/L Tris-HCl緩沖液；pH10.0～12.0為0.2mol/L甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液。

1.2.7 最適溫度和熱穩定性的分析

在pH6.0條件下測定25～60℃的酶活力，確定酶的最適溫度。將適當稀釋的酶液在不同溫度(40、45、50、55、60℃)條件下分別處理10、20、30、40min后，在40℃、pH6.0條件下測定剩余酶活力，觀察酶的熱穩定性。

1.2.8 部分金屬離子和試劑對GOD活性的影響

在反應體系中分別加入濃度均為2.0mmol/L的金屬離子(Mg2+、Ca2+、Fe2+、Co2+、Mn2+、Ni2+、Hg2+、Ag+、Zn2+、Cu2+、Al3+)和試劑(5.0mmol/L的EDTA、NaN3、2.0mmol/L NaF以及0.2%的SDS、Triton X-100、吐溫-20)，測定酶活力，以未加入化學試劑的酶液做對照，觀察金屬離子和試劑對酶活力的影響。

1.2.9 米氏常數(Km)的測定

在40℃、pH6.0條件下，變化葡萄糖濃度(6～120mmol/L)，測定GOD酶活力。采用Lineweaver-Burk雙倒數作圖法測定GOD對底物葡萄糖的Km。

1.2.10 GOD的光譜特征

在UV-2102紫外分光光度計上對GOD進行自然條件下的紫外光譜測定，掃描波長200～340nm。用蒸餾水做對照調節基線。

在F-4500熒光分光光度計上對GOD進行自然條件下的內源熒光光譜測定，以280nm為激發波長。其中，光徑1cm，激發與發射光夾縫為5nm，光電倍增管的電壓為700V，掃描速率1200nm/min。

1.2.11 GOD的液體保存穩定性

將過濾除菌后的液體GOD純酶分別放置在4、25℃和37℃條件下，每隔一段時間測定剩余酶活性，考察GOD的保存穩定性。

2 結果與分析

2.1 酶的分離純化

取3 0 0 m L 發酵液經高速冷凍離心，濃縮，透析除鹽后為20mL，上Q-Sepharose Fast Flow層析柱(3cm×4cm)，洗脫曲線見圖1，蛋白含量和酶活性最高的部分均為50～150mL。純化前后電泳圖譜見圖2，純化后得到單一蛋白條帶，酶比活力由54.08U/mg提高到73.17U/mg，純化1.35倍，收率達92.7%(表1)。純化的葡萄糖氧化酶經SDS-PAGE(還原/非還原條件下)鑒定，由標準蛋白可知該酶分子肽鏈的分子質量約為75kD(圖3)。通過梯度PAGE測得GOD全酶分子質量約為150kD(圖4)。

pH值對GOD酶活性的影響結果(圖5)表明，該酶在pH6.0時活性最大；在pH5.0～8.0之間較穩定，催化活力無明顯變化，而酶在pH4.0以下或pH9.0以上，其穩定性迅速下降。溫度對酶活性的影響結果(圖6)表明，該酶的最適溫度為40℃，在30～50℃之間有較高的酶活力，60℃及以上活力較低；將酶液在50℃以下作用20min，活性基本不變，高于55℃后酶穩定性降低，在60℃保溫40min，酶基本失活。

表 1 重組葡萄糖氧化酶的純化結果Table 1 Summary of isolation and purification of recombinant P.pastoris GOD

圖 1 離子交換層析圖Fig.1 Elution profi le of GOD on Q-Sepharose Fast Flow column

圖 2 純化前后葡萄糖氧化酶的SDS-PAGE電泳Fig.2 SDS-PAGE of crude and purifi ed GOD

圖 3 純化后GOD的SDS-PAGEFig.3 SDS-PAGE pattern for molecular weight determination of purifi ed GOD

圖 4 純化后GOD的梯度PAGEFig.4 Gradient PAGE of purifi ed GOD

2.2 pH值和溫度對GOD酶活力的影響

圖 5 葡萄糖氧化酶的最適pH值(A)和酸堿穩定性(B)Fig.5 Optimum pH (A) and pH stability (B) of GOD

圖 6 葡萄糖氧化酶的最適溫度(A)和溫度穩定性(B)Fig.6 Optimum temperature and temperature stability of GOD

pH值對酶活性的影響結果(圖5)表明，該酶在pH6.0時活性最大；在pH5.0～8.0之間較穩定，催化活力無明顯變化，而酶在pH4以下或pH9以上，其穩定性迅速下降。溫度對酶活性的影響結果(圖6)表明，該酶的最適溫度為40℃，在30～50℃之間有較高的酶活力，60℃及以上活力較低；將酶液在50℃以下作用20min，活性基本不變，高于55℃后酶穩定性降低，在60℃保溫40min，酶基本失活。

2.3 部分金屬離子、表面活性劑和有機溶劑對GOD活性的影響

表 2 不同化學試劑對重組GOD活性的影響Table 2 Effects of different chemicals on GOD activity

由表2可知，Hg2+、Ag+、Cu2+、Fe2+對葡萄糖氧化酶有強烈的抑制作用，2.0mmol/L Ag+、Cu2+、Fe2+均可使酶活力完全喪失，其他金屬離子對葡萄糖氧化酶的活力影響不大。表面活性劑SDS對GOD有抑制作用，0.2% SDS作用后酶活力剩余77%。

2.4 米氏常數的測定結果

以6～120mmol/L葡萄糖為底物，在pH6.0、40℃條件下，測定底物反應速率，按Lineweaver-Burk法作圖(圖7)，求出葡萄糖氧化酶的Km為21.06mmol/L。

圖 7 葡萄糖氧化酶的Lineweaver-Burk曲線Fig.7 Lineweaver-Burk plot of GOD

2.5 GOD的光譜特征

圖8是GOD溶液在200～340nm波長范圍掃描得到的GOD紫外吸收光譜曲線，結果顯示GOD在波長275nm處有最大光吸收。圖9是在280nm波長激發下得到的GOD熒光發射光譜，最大峰位于344nm處。

圖 8 自然狀態下GOD的紫外光譜圖Fig.8 Ultraviolet absorption of GOD

圖 9 GOD的內源熒光光譜(280nm激發)Fig.9 Fluorescence absorption of GOD

2.6 GOD的液體保存穩定性結果

圖 10 葡萄糖氧化酶的液體保存穩定性Fig.10 Storage ability of GOD in water

將純化后的液體葡萄糖氧化酶樣品除菌后分別在4、25、37℃條件下放置一段時間后，在最適條件下測定其酶活力。由圖10可知，在4℃條件下放置6個月活性沒有損失。常溫25℃放置10d酶活力仍有76%，放置20d后仍有酶活力約56%；37℃條件下酶活力下降較為明顯，1d后約有酶活力70%，10d后酶活力有20%。總體來說，在液體狀態下，葡萄糖氧化酶在冷藏下是穩定的，常溫下可放置3～5d。

3 討 論

本實驗從甲醇畢赤酵母發酵的上清液中得到的葡萄糖氧化酶，雜蛋白含量低，且不需破碎菌體，只經過一步離子交換層析就可以達到電泳純，純化收率高達92.7%，張茜等[11]從青霉中提取的GOD和蘇茉等[12]從黑曲霉中提取的GOD都需要經過DEAE離子交換層析和凝膠過濾層析兩步才能純化，時間和費用成本相對較高，蘇茉等[12]純化的收率也僅為30.2%。另外本實驗省去了上樣量小，耗時長的凝膠過濾層析，有利于大規模純化。有關文獻[11,13-14]報道葡萄糖氧化酶是分子質量在150～170kD之間的二聚體，本實驗純化得到的酶分子質量為150kD，亞基分子質量為75kD，與報道相符。

本實驗得到的GOD純品的最適pH值為6.0，在pH5.0～8.0之間都可以穩定存在，由此可見該酶的pH值穩定范圍較寬，酸堿耐受性很強，適于工業生產。提純的葡萄糖氧化酶的最適溫度為40℃，在50℃條件下保溫30min仍有90%酶活力，可見該酶的熱穩定性良好，在食品工業中可以適用不同的滅菌條件，溫度高對防止雜菌的生長也很有利，因此提純的GOD有很高的應用價值。

不同來源的GOD的Km值不同，周亞鳳等[15]報道的黑曲霉葡萄糖氧化酶的Km值為38.25mmol/L，張茜等[11]純化的青霉菌葡萄糖氧化酶Km值為122.6mmol/L，Rando等[16]報道的GOD的Km值為6.2mmol/L，王志新等[17]測得的黑曲霉A9葡萄糖氧化酶的Km為35.74mmol/L。Km值表征酶與底物親和力的大小，Km越小，親和力越大，本實驗中測得的GOD的Km值為21.06mmol/L，顯示本實驗得到的GOD對葡萄糖的親和力較好。

在蛋白質中Trp、Tyr、Phe等殘基可以吸收紫外光[18]，因此蛋白質溶液對一定波長范圍的紫外光具有吸收值，葡萄糖氧化酶在275nm波長處有最大光吸收，符合其特征吸收峰。在蛋白質分子中，能夠發射熒光的氨基酸為Phe、Tyr和Trp，以280nm為激發波長得到的熒光發射光譜是由Trp和Tyr等殘基共同生成[19-20]，并沒有出現由Tyr基團產生的熒光峰(303nm)，因此說明天然GOD的內源熒光來自Trp基團，在GOD分子內可能由于Tyr與Trp距離很近而產生了從Tyr與Trp的能量轉移，與其游離Trp基團的最大熒光發射峰348nm相比，藍移至344nm，藍移了4nm。蛋白質分子中Trp如果位于蛋白質分子表面，其最大熒光發射峰應當在342～350nm之間，如果Trp位于蛋白質分子內部，最大熒光發射峰應當在326～342nm之間，如果Trp位于非極性環境中，最大熒光發射峰應當在310～324nm之間。實驗結果表明在GOD分子內Trp基團可能位于分子表面。

該酶被Hg2+、Ag+、Cu2+、Fe2+強烈抑制，Mg2+、Ca2+、Mn2+等對酶活性幾乎沒有影響，由此可見葡萄糖氧化酶在測定含有上述離子的樣品時不會有明顯影響，所以此酶可廣泛應用于血糖含量的測定。液體狀態下該酶可長期冷凍保存，在常溫下也可保存3～5d，有利于該酶在生物傳感器方面的應用。綜上所述，葡萄糖氧化酶具有很大的應用潛力，適用于食品、醫療、生物等行業。但是液體葡萄糖氧化酶在37℃條件下的保存時間較短，將該酶固定化來提高其穩定性方面還可做進一步的研究。

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