草酸青霉果膠酶分離純化工藝及酶學性質研究

張名愛，王寶維,*，岳 斌，荊麗珍,3，葛文華

(1.青島農業大學食品科學與工程學院，山東 青島 266109；2.青島農業大學優質水禽研究所，山東 青島 266109；3.海陽市畜牧獸醫站，山東 煙臺 265100)

酶的分離純化是研究酶的結構、功能乃至認識酶的分子本質的前提。微生物產生的果膠酶多為胞外酶，得到酶粗提物后，分離純化的第一步就是根據酶蛋白質溶解度性質，采用中性鹽鹽析法、有機溶劑沉淀法、等電點沉淀法或者聚乙二醇沉淀法等將目的蛋白沉淀出來。多數果膠酶分離純化是以硫酸銨分級沉淀作為首選的粗提純方法。進一步的純化通常根據目的酶的分子質量大小、電荷性質、親和專一性等，采用凝膠層析、離子交換、親和層析等諸多方法。目前，國內外有關動物源果膠酶生產菌株未見報道，尤其是有關鵝源草酸青霉產果膠酶特性的研究尚處于空白；對于果膠酶不同組分的分離純化，國內外的報道主要集中于聚半乳糖醛酸酶(PG)組分[1-2]，尚未見有關動物源草酸青霉產果膠酶分離純化工藝的研究。本實驗對鵝源草酸青霉產果膠酶主要組分PG和果膠酯酶(PE)進行分離純化，并進行相關酶學性質研究，旨在探索出高效、簡單和低耗的新型果膠酶純化工藝。此外，本實驗所使用的果膠酶產生菌來自家禽體內，更能有效地適應動物體內環境，能耐動物腸道內pH值，且能在動物體內定殖，為研發新型酶制劑提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實驗所用菌株是由青島農業大學優質研究所首次從鵝盲腸中分離篩選得到[3]。該菌經中國科學院微生物研究所實驗室鑒定，為草酸青霉(Penicillium oxalicum Currie &Thom)，微生物保藏號為CGMCC NO.2260。

硫酸銨 北京康普匯維科技有限公司；Sephacryl S-200凝膠 上海嶸崴達實業有限公司；DEAE葡聚糖凝膠、十二烷基硫酸鈉(SDS) 上海雅吉生物科技有限公司；低分子質量標準蛋白 Fermentas中國公司；丙烯酰胺 上海源葉生物科技有限公司；雙丙烯酰胺 北京中諾泰安科技有限公司；N,N,N,N’-四甲基乙二胺(TEMED) 上海億欣生物試劑公司；過硫酸銨(Ap) 上海將來試劑有限公司；β-巰基乙醇(β-ME) 上海艾研生物科技有限公司；BSA試劑盒 上海陽光試劑有限公司。所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

MDF-U5411超低溫冰箱 日本三洋公司；BC-163 BD-93D冰箱 青島海爾電冰箱股份公司；TGL-16G高速冷凍離心機 上海安亭科學儀器廠；SL-2數控層析冷柜 北京四環科學儀器廠；BS-100A自動部分收集器 上海滬西分析儀器廠；BT00-50M蠕動泵 保定蘭格恒流泵有限公司；LGJ-3冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器有限公司；BS-1601核酸蛋白分析儀 日本島津公司；12C電泳儀 北京市六一儀器廠；移液器 德國Eppendorf公司；AR2140電子天平 美國奧豪斯公司；LX-C35L立式壓力蒸汽滅菌鍋 合肥華泰醫療設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 果膠酶的分離純化

由從鵝腸道分離的草酸青霉為生產菌株，在最適培養條件下[4]發酵得到目的產物，以滅菌生理鹽水浸提45min，得到發酵液。將發酵液進行硫酸銨鹽析，將粗酶液脫鹽濃縮，采用Sephacryl S-200分子篩初級分離和DEAE-Sephadex離子交換層析分離純化得到果膠酶，對目的產物進行蛋白濃度測定和酶學性質研究。

1.3.2 純化物的鑒定

以SDS-PAGE方法鑒定純化物。

1.3.3 純化

1.3.3.1 (NH4)2SO4分級沉淀

將粗酶液于4℃、10000r/min離心30min去除固形物，向酶液中加入(NH4)2SO4并進行有規則攪拌，4℃放置24h，觀察并測定上清液中PG和PE活力。(NH4)2SO4飽和度為20%～100%。

1.3.3.2 PG、PE的分子篩層析

分別經飽和度60%～100% (NH4)2SO4沉淀、脫鹽、濃縮初步純化的粗酶液用Sephacryl S-200分子篩柱(1.6cm×70cm)分離純化，每次上樣量2mL。分別采用pH5.2和pH5.0的0.04mo1/L Na2HPO4-0.02mo1/L檸檬酸緩沖液洗脫，流速1.5mL/min。

1.3.3.3 PG、PE組分DEAE-Sephadex A-50離子交換洗脫pH值的選擇

根據Test-tube方法[5]確定DEAE-Sephadex A-50離子交換洗脫液的pH值。

1.3.3.4 PG、PE組分DEAE-Sephadex A-50離子交換洗脫

用透析袋和聚乙二醇20000濃縮，將透析袋一端密封后，裝入100mL原液，另一端也密封，用聚乙二醇20000濃縮，收集濃縮液，分別用pH6.5和pH5.0的0.04mo1/L Na2HPO4-0.02mo1/L檸檬酸緩沖液透析，并分別用pH6.5和pH5.0的0.04mo1/L Na2HPO4-0.02mo1/L檸檬酸緩沖液和0～1mo1/L NaCl線性梯度洗脫，在280nm波長處測吸光度，收集含蛋白部分。測定各管酶活力，收集酶活性部分洗脫液，然后進行真空冷凍濃縮處理。洗脫部分測定酶活力后收集活性部分，測定蛋白濃度，最后通過不連續SDS-PAGE凝膠電泳，對純化物進行鑒定。

1.3.3.5 PG、PE組分酶學性質研究

在pH2.0～8.0的0.2mo1/L Na2HPO4-0.lmol/L檸檬酸緩沖液中進行酶促反應，測定不同條件下PG、PE的酶活力；在最適反應pH值的0.2mo1/L Na2HPO4-0.lmol/L檸檬酸緩沖體系中，PG、PE酶液分別與0.01g/mL果膠溶液在35～65℃溫度條件下進行酶促反應；采用pH2.0～8.0經0.2mo1/L Na2HPO4-0.lmol/L檸檬酸緩沖液處理純化后的PG、PE酶液，在4℃低溫條件下靜置4h，調節pH值至5.0后測定酶活力；將酶液置于30、40、50、60、70℃溫度條件下的水浴中保溫處理，每隔15min取2mL酶液，立即置于冰浴中冷卻，測定PG和PE的殘余酶活力。

1.4 數據處理

用SAS統計軟件建立數據庫并處理數據。結果組間差異用One way ANOVA檢驗，兩組間差異采用LSD法進行多重比較，數據以±s表示。

2 結果與分析

2.1 (NH4)2SO4分級沉淀預實驗

圖 1 (NH4)2SO4質量分數對PG、PE組分沉淀的影響Fig.1 Effect of ammonium sulfate concentration on precipitation of PG and PE

由圖1可知，粗酶中PG、PE的(NH4)2SO4分級沉淀質量分數分別為60%～100%、70%～100%。

2.2 PG、PE的分子篩層析

圖 2 PG、PE組分 Sephacryl S-200分子篩層析洗脫曲線Fig.2 Elution profi le of PG and PE on Sephacryl S-200 fi ltration chromatography

由圖2可知，PG組分初步分離粗提物出現了3個主要的蛋白峰，第2、3兩個蛋白峰峰尖之間，經測定有PG活力，收集各管洗脫液為目的蛋白所在的洗脫液；PE組分初步分離粗提物出現了2個主要的蛋白峰，第2個蛋白峰經測定有PE活力，收集各管洗脫液為目的蛋白所在的洗脫液。

2.3 PG、PE組分DEAE-Sephadex A-50離子交換洗脫pH值的選擇

圖 3 PG、PE組分DEAE-Sephadex A-50離子交換洗脫pH值的確定Fig.3 pH selection of elution buffer for PG and PE on DEAE-Sephadex A-50

由圖3可知，采用不同pH值離子交換洗脫液進行洗脫，上清液酶活力呈逐漸下降趨勢，當酶活力達到最低時的pH值洗脫液為最佳pH值。pH6.5時，上清液中只含有少量PG酶活力，故選擇pH6.5的緩沖體系作為PG組分DEAE-Sephadex A-50離子交換洗脫純化所用的洗脫液；pH5.0時，上清液中只含有少量PE酶活力，故選擇pH5.0的緩沖體系作為PE組分DEAE-Sephadex A-50離子交換洗脫純化所用的洗脫液。

2.4 PG、PE組分DEAE-Sephadex A-50離子交換洗脫

圖 4 PG、PE組分DEAE-Sephadex A-50離子交換洗脫Fig.4 Elution profi le of PG and PE on DEAE-Sephadex A-50

由圖4可知，PG和PE組分均出現2個蛋白峰，說明用離子交換洗脫可以將不同酶組分分離，測定各管酶活力的最高者即為目的組分。經酶活力測定，第2個蛋白峰有PG活力，第1個蛋白峰有PE活力。

2.5 蛋白得率及純化倍數

表 1 草酸青霉產聚半乳糖醛酸酶、果膠酯酶的分離純化結果Table 1 Purifification of PG and PE from Penicillium oxalicum

由表1可知，草酸青霉菌株發酵粗酶液中分離得到的PG和PE純酶，酶活回收率分別為50.97%和44.64%，純化倍數分別為32.21和23.98。由此可見，2種組分的純化倍數均較高。

2.6 SDS-PAGE電泳結果

圖 5 草酸青霉果膠酶PG(a)、PE(b)純化后SDS-PAGE電泳結果Fig.5 SDS-PAGE of purifi ed PG (a) and PE (b) from Penicillium oxalicum

將提純的PG、PE組分酶樣品和低分子質量標準蛋白進行SDS-PAGE電泳，經SDS-PAGE電泳檢測為1條帶，均達到了電泳純。由圖5可知，PG、PE分子質量分別為61.4、42.2kD。

2.7 PG、PE組分酶學性質研究

2.7.1 pH值對PG、PE酶活力的影響

圖 6 pH值對PG、PE酶活力的影響Fig.6 Effect of pH on PG and PE activity

由圖6可知，2種組分酶活力隨著pH值的升高均呈先上升后下降的趨勢，且其受pH值影響顯著。當pH值為5.0時，PG活力最高，為6282.35IU；與其他組相比，差異顯著(P＜0.05)或極顯著(P＜0.01)；在pH值為6.0時，PE活力達到最高，為8355.55 IU，因此PE的最適反應pH值為6.0。

2.7.2 溫度對PG、PE活力的影響

圖 7 溫度對PG、PE酶活力的影響Fig.7 Effect of temperature on PG and PE activity

由圖7可知，隨著反應溫度的升高PG和PE的酶活力均呈先上升后下降趨勢。在35～65℃溫度范圍內，PG活力先隨溫度升高而增大，但溫度超過45℃后，PG活力又開始顯著下降(P＜0.05)。因此，PG的最適反應溫度為40℃，此時PG活力達到5778.41IU；隨著溫度的升高，PE活力顯著上升(P＜0.05)，當溫度為50℃時，PE活力最大，為5654.72IU；當溫度超過50℃時，PE活力又開始下降。因此，PE的最適反應溫度為50℃。

2.7.3 PG、PE的pH值穩定性

圖 8 PG、PE的pH值穩定性Fig.8 Effect of pH on PG and PE stability

由圖8可知，pH值在4.0～6.0范圍內酶活力變化不顯著，PG酶活力能夠保持穩定；但當pH值超過7.0或低于4.0時，其酶活力顯著(P＜0.05)或極顯著下降(P＜0.01)。 pH值在2.0～5.0范圍內，PE活力顯著或極顯著上升(P＜0.05或P＜0.01)；在pH5.0～7.0范圍內，PE活力基本穩定，并且顯著(P＜0.05)或極顯著(P＜0.01)高于其他pH值范圍；當pH值超過7.0后，PE活力開始降低。

2.7.4 PG、PE的熱穩定性

圖 9 PG、PE的熱穩定性Fig.9 Effect of temperature on PG and PE stability

由圖9可知，純化后的PG隨著處理時間的延長，酶活力逐漸下降。在30、40℃時，在0～105min范圍內，各處理組之間酶活力差異不顯著；50～70℃之間，隨著處理時間的延長，各組之間酶活力逐漸下降，且與對照組相比差異顯著(P＜0.05)或極顯著(P＜0.01)。純化后的PE在30℃時熱穩定性較好，在0～105min以內，各處理組之間酶活力變化差異不顯著；40℃處理時間少于60min，酶活力變化不明顯，而處理120min時仍能保持60%以上的活力；其他各組隨著處理時間的延長，PE活力顯著(P＜0.05)或極顯著下降(P＜0.01)。

3 討 論

3.1 層析介質選擇對純化結果的影響

在對各種酶的性質進行研究時，為排除其他雜蛋白(酶)的影響，必須進行分離提純。果膠酶分離提純的方法有多種，但大多數均采用離子交換柱層析和凝膠過濾相結合的方法[6-7]。近年來，研究者[8-9]根據果膠酶的底物專一性強的特點，采用疏水層析或親和層析的方法分離提純果膠酶也取得較好的效果。本實驗從現有條件出發，根據已掌握的草酸青霉產果膠酶特性，采用(NH4)2SO4鹽析、透析袋脫鹽、PEG20000濃縮、DEAE-Sephadex A-50離子交換、Sephacryl S-200凝膠過濾等方法，分離提純草酸青霉產果膠酶中的PE和PG組分。

3.2 PE和PG最適作用溫度

低溫酶具有最適溫度低、在低溫條件下催化效率高、熱穩定性差等特征。陳秀蘭等[10]報道的低溫酶的最適酶活溫度大部分為30～40℃，如Hamamoto等[11]報道Psedomonas fluorescens 114所產蛋白酶的最適溫度為30～40℃，Oh等[12]報道Azospirill屬所產酶的最適溫度為40℃。本實驗分離菌株產生的PG最適反應溫度為40℃，此溫度與動物消化道溫度一致，能夠更好地促進營養物質的消化吸收，因此該酶比較適合作為飼料添加劑。PE在40℃時處理120min，仍能保持60%以上的活力，但PE最適作用溫度50℃比畜禽消化道內的溫度高，難以達到最大的催化效力。因此應對其進行分子改性方面的研究，以期使其最適溫度與作用環境溫度一致。本實驗酶學特性相關研究結果為該酶在飼料上的應用以及進一步的分子生物學研究提供一定的參考。

3.3 PE和PG最適作用pH值

PG最適作用pH值為5.0，pH值穩定范圍為4.0～6.0，說明該酶有較好的酸穩定性。湯鳴強[13]曾報道純化后黑曲霉PG的最適反應pH值為3.0，pH值穩定范圍為2.6～3.4。可見，本實驗純化的PG組分具有與其有相似的酸堿穩定性，而且更易在酸性環境條件下發揮作用。

3.4 純化結果的鑒定比較

從純化結果看，此純化方法是適用的。2個組分分別達到電泳純。PG、PE組分的純化倍數分別為32.21和23.98。PG分子質量約為61.4kD，從國內以往研究結果來看，本實驗結果大于文獻[9,14]報道的35、37、41.8kD，而又小于王紅梅等[15]所報道的80kD，這可能是由于PG組分的來源不同，導致PG分子質量有所不同。PE分子質量為42.2kD，該結果與Khanh等[16]報道的43kD一致。

4 結 論

鵝源草酸青霉果膠酶的PG和PE組分分子質量分別為61.4、42.2kD，純化倍數分別為32.21和23.98。 PG酶活性最佳的pH值為5.0，反應溫度為40℃，pH值穩定范圍為4.0～6.0，在30、40℃時，隨著處理時間的延長，各處理組之間酶活力基本保持不變；超過40℃后，隨著處理時間的延長，酶活力逐漸極顯著下降。PE酶活性最佳的pH值為6.0，反應溫度為50℃，pH值穩定范圍為5.0～7.0，在30℃時熱穩定性較好。

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