榛子仁蛋白酶解工藝的優化及酶解物抗氧化能力的研究

郭慶啟，張 娜，姜元松，鄒傳山

(1.東北林業大學林學院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.哈爾濱商業大學 食品科學與工程黑龍江省高校重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150076)

天然功能食品不僅具有良好的抗氧化和清除自由基能力，而且對機體沒有任何毒副作用，已成為抗氧化活性物質領域研究的新方向[1-2]。抗氧化肽是生物活性肽的一種，其特點是分子質量小，易吸收[3]，在體內能通過減少自由基和抑制脂質過氧化而達到抗氧化和抗衰老的功能[4-5]。對比于目前廣泛使用的化學合成抗氧化劑，通過酶法、發酵法等生物技術從天然動植物來源的蛋白質中得到的抗氧化肽具有來源廣泛[6]、無毒副作用和抗氧化性質較穩定等優點[7-8]。

作為世界四大堅果之一的榛子，在我國東北地區具有豐富的資源，但榛子類保健食品在市場上并不多見，目前主要是對榛子仁進行直接食用或制成榛子油、榛子粉等粗加工產品，并沒有進行高附加值的精深產品開發。對于提取榛子油之后得到的榛子仁粕，其中的蛋白質含量較高，是一種優良的抗氧化肽的來源[9]，而目前僅作為飼料使用。本研究以榛子去油后的榛子仁粕為原料，通過響應面法優化Alcalase堿性蛋白酶水解榛仁蛋白質的工藝條件，并對水解物的總還原能力和DPPH自由基清除能力進行研究與比較，為榛子仁抗氧化肽的開發和利用提供理論基礎和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

榛子(Corylus mandshurica)購自伊春市五營林業局，采集時間為2011年9月份，手工去殼后40℃條件下對流干燥。

Alcalase堿性蛋白酶 丹麥Novo Nordisk公司；DPPH自由基標準品 美國Sigma公司；所用化學試劑均為分析純。

TU-1800SPC紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；SHB-3循環水多用真空泵 鄭州杜甫儀器廠；FW135型中藥粉碎機 天津泰斯特儀器有限公司；pHS-3C型酸度計 上海雷磁儀器廠；HA221-50-60型超臨界CO2萃取裝置 江蘇南通華安超臨界萃取有限公司；Kjeltec2300型定氮儀 瑞典Foss公司；44C2-A型冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器有限公司；TGL-5離心機 上海安亭科學儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 榛子仁的預處理

將榛子仁粉碎后過40目篩，采用超臨界CO2萃取方法對榛仁粉進行脫脂處理，萃取溫度50℃，萃取壓力20MPa，萃取時間3h，測得去油后的榛子仁粕的蛋白質含量為(76.72±0.14)%。

1.2.2 榛子仁粕蛋白酶解工藝的優化

取3.0g榛子仁粕于三角瓶中，用一定比例的蒸餾水攪拌溶解，在100℃條件下預處理30min后冷卻，按一定的酶與底物比加入Alcalase堿性蛋白酶，采用NaOH溶液和恒溫水浴保持體系的pH值和溫度恒定，水解一定時間后沸水浴滅酶，過濾，取濾液1mL定容至50mL進行水解度的測定[10]。分別考察酶與底物比、酶解溫度、酶解時間和酶解pH值4個因素對水解度的影響，在單因素試驗的基礎上，進行響應面優化設計與分析。

將榛子仁粕在最佳酶解工藝條件下水解，3500r/min離心10min后取上清液真空冷凍干燥，取榛子粕蛋白酶解物進行抗氧化能力的測定；同時配制不同質量濃度的VC溶液，按下述方法進行總還原能力和DPPH自由基清除能力的測定。

1.2.3 酶解物總還原能力的測定

準確移取1.0mL樣液于試管中，分別加入2.5mL 0.2mol/L pH6.6磷酸緩沖液和2.5mL 1g/100mL鐵氰化鉀溶液，于50℃水浴中保溫20min，快速冷卻，再加入2.5mL 10g/100mL三氯乙酸溶液，4000r/min離心10min，取上清液2.5mL，依次加入2.5mL蒸餾水、0.5mL 0.1g/100mL三氯化鐵溶液，充分振蕩，靜置10min后在700nm波長處測其吸光度。取1.0mL 蒸餾水為空白對照液，同以上操作參比調零，以吸光度表示總還原能力的大小[11]。

1.2.4 酶解物DPPH自由基清除能力的測定

準確移取1.0mL樣液于試管中，加入2.0mL 0.1mmol/L DPPH溶液振蕩搖勻，1.0mL蒸餾水與2.0mL 0.1mmol/L DPPH溶液混合作為空白對照，常溫避光反應60min后在517nm波長處測其吸光度，以蒸餾水參比調零[12]。DPPH自由基清除率見下式。

式中：A0為對照樣品的吸光度；A為樣品的吸光度。

2 結果與分析

2.1 Alcalase堿性蛋白酶酶解條件的單因素試驗研究

2.1.1 不同酶與底物比對水解度的影響

圖 1 不同酶與底物比對水解度的影響Fig.1 Effect of enzyme/substrate ratio on degree of hydrolysis

當酶解液的pH值為8.0、酶解時間90min、酶解溫度50℃時，不同酶與底物比條件下的榛子仁粕的水解度，如圖1所示，隨著酶與底物比的增加，Alcalase堿性蛋白酶水解榛子仁粕蛋白質的水解度一直呈現上升的趨勢，當酶與底物比為4000U/g時，水解度為(14.37±0.08)%，然后水解度的增加趨于平緩。在酶解過程中，作為大分子的蛋白質減少而生成小分子形式的肽，生成的肽作為蛋白酶的底物會進一步的水解生成分子質量更小的短肽，二者在酶解過程中存在著與蛋白酶的競爭性結合作用[13]。隨著酶用量即酶與底物比的增加，體系反應的初速度很快，使得大部分的蛋白質在較短的時間內降解為肽，當蛋白質減少到一定程度時再增加酶的量，其與蛋白質發生作用的幾率會大大降低，體現在水解度的增加趨于平緩，由于此時蛋白酶作用的底物主要是肽，因此水解肽也會引起水解度的緩慢上升，但其增幅已經很小[14]，因此確定Alcalase堿性蛋白酶水解榛子仁蛋白的最適酶與底物比為4000U/g。

2.1.2 不同溫度對水解度的影響

圖 2 不同溫度對水解度的影響Fig.2 Effect of temperature on degree of hydrolysis

當酶解液pH8.0、酶解時間90min、酶與底物比4000U/g時，不同溫度條件下的榛子仁粕的水解度，結果見圖2。蛋白酶分子穩定性與酶解時的溫度是密切相關的，當酶解溫度超過某一界限時，極易引起次級鍵的解離，從而使蛋白酶部分或完全失活，而酶解溫度低時，又會大大降低體系內分子運動的激烈程度，從而降低蛋白酶與底物的作用幾率[15]，因此蛋白酶水解時存在著其最適反應溫度條件，由圖2可知，Alcalase堿性蛋白酶水解榛子仁粕蛋白的最適酶促反應溫度為50℃。

2.1.3 酶解時間對水解度的影響

圖 3 不同酶解時間對水解度的影響Fig.3 Effect of hydrolysis time on degree of hydrolysis

當酶解液pH8.0、酶與底物比4000U/g、酶解溫度50℃時，不同酶解時間條件下的榛子仁粕的水解度，結果見圖3。實驗分析了0～180min范圍內的不同酶解時間對水解度的影響趨勢，由圖可知，隨著水解時間的延長，水解度一直呈現增加的趨勢，但90min后增加的趨勢趨于平緩，這可能是由于Alcalase本身為一種復合蛋白酶，其由內切酶和端切酶所組成，在酶促反應過程中，隨著內切位點的減少使端切酶的活力開始有所體現，也表現為水解度的上升，但上升過程緩慢。

2.1.4 酶解pH值對水解度的影響

圖 4 酶解pH值對水解度的影響Fig.4 Effect of pH on degree of hydrolysis

當酶解溫度50℃、酶解時間90min、酶與底物比4000U/g時，不同酶解pH值條件下的榛子仁粕的水解度，如圖4所示，酶解時pH值的變化對水解度的影響較顯著，呈現先升高后下降的趨勢，其最佳水解pH值為8.5，表明Alcalase復合酶更適合于在偏堿性的條件下發生水解作用。

2.2 Alcalase堿性蛋白酶酶解榛子仁蛋白工藝的響應面優化設計及分析

由于酶解時間的變化對水解度影響較小，因此在單因素試驗的基礎上，選取酶與底物比、酶解溫度和酶解pH值3個因素為變量，分別表示為x1、x2、x3，以水解度為響應值[16]，根據Box-Behnken中心組合設計因素水平編碼值。利用Design-Expert 7.0設計響應面試驗方案，實驗測定結果如表1。

表 1 Alcalase堿性蛋白酶水解榛子仁蛋白的響應面試驗設計及結果Table 1 Experimental design and results for the response surface analysis to optimize the hydrolysis of hazelnut kernels with alcalase

2.3 響應面試驗結果分析

通過統計分析軟件SAS9.1對表1中實驗數據進行二次多項式回歸擬合，建立二次多元回歸方程如下：

水解度/%=－148.25425+0.002857x1+4.353x2+ 11.1815x3－4.08×10-7x12－4.075×10-5x1x2－0.05702x22+ 2.65×10-4x1x3+0.185x2x3－1.272x32

回歸分析與方差分析結果見表2。

表 2 響應面模型方差分析Table 2 Analysis of variance for the fitted response surface model

由表2可知，方程F值為25.46，表明模型因變量與自變量之間的線性關系明顯，該模型回歸極顯著(P＜0.01)，失擬項顯著(P＜0.05)。該模型R2=97.04%，R2Adj=93.22%，說明模型與實驗擬合較好，自變量與響應值之間線性關系顯著，可以用于該反應的理論推測[17]。

P水平是檢驗編碼變量對水解度指標的影響是否顯著，當P＜0.05時表明變量影響顯著；當P＜0.01時表明變量影響極顯著[18]；當0.01＜P＜0.05時表明影響顯著。從表2可以看出，x1、x2、x1x2、x2x3、x12和x22項達到了顯著的水平，其中酶與底物比和酶解溫度、酶解溫度和水解pH值間存在著交互作用，具體交互作用如圖5所示。

圖 5 酶與底物比、酶解溫度和酶解pH值交互作用影響水解度的響應曲面圖Fig.5 Response surface plots indicating the effects of three hydrolysis parameters on degree of hydrolysis

應用響應面尋優分析方法對回歸模型進行分析，尋找最優響應結果為：酶與底物比3720U/g、酶解溫度50.6℃、酶解pH 8.4，最大水解度預測值為14.41%；在此工藝條件下進行3次平行實驗，得到水解度的實測值為(14.38±0.06)%，說明實驗值與回歸方程的預測值之間吻合程度很高。

2.4 酶解物的總還原能力

由圖6可知，無論是榛子仁蛋白酶解物還是VC，隨著質量濃度的增加其總還原能力均呈現增加的趨勢。相同質量濃度條件下，雖然榛子仁蛋白酶解物的總還原能力要低于VC，但已表現出較高的抗氧化活性，其總還原能力約為VC的70%，是一種優良的植物源天然抗氧化劑。

圖 6 榛子仁蛋白酶解物和VC的總還原能力Fig.6 Comparison of total reducing power between hazelnut kernel hydrolysate and VC

2.5 酶解物的DPPH自由基清除能力

圖 7 榛子仁蛋白酶解物(a)和VC(b)對DPPH自由基的清除效果Fig.7 Comparison of DPPH radical scavenging effect between hazel protein enzyme hydrolysate (a) and VC (b)

DPPH是一種有機自由基，物質對于DPPH自由基的清除效果是目前被作為其是否具有抗氧化能力的重要指標之一[19]。不同質量濃度條件下的VC和榛子仁蛋白酶解物的DPPH自由基清除效果，如圖7所示，隨著VC和酶解物質量濃度的增加，其清除DPPH自由基的效果增強，實驗數據采用Excel 2007進行多項式回歸，通過質量濃度與DPPH自由基清除率之間的線性關系[20]，計算出VC對DPPH自由基清除能力的IC50為0.0053mg/mL，榛子仁蛋白酶解物的IC50為0.7311mg/mL。盡管榛子仁蛋白酶解物具有清除DPPH自由基的效果，但當其達到與VC相同的清除能力時，需要其質量濃度約為VC質量濃度的138倍，可見榛子仁蛋白酶解物對于DPPH自由基的清除能力要明顯的低于VC的清除效果。

3 結 論

3.1 通過三因素三水平的響應面分析試驗得到Alcalase堿性蛋白酶水解榛子仁粕的數學模型，經SAS軟件分析，該模型能夠較好的模擬Alcalase堿性蛋白酶酶解制備榛子仁蛋白肽的過程，最佳水解工藝參數為：酶與底物比3720U/g、酶解溫度50.6℃、酶解pH8.4，此工藝條件下的水解度預測值為14.41%，水解度實測值為(14.38±0.06)%。

3.2 榛子仁蛋白酶解物的抗氧化能力測定結果表明：與VC相比，酶解物的總還原能力較強，且抗氧化能力與質量濃度呈現一定的量效關系；但DPPH自由基的清除能力較弱，相同清除能力時，酶解物的半數抑制質量濃度約為VC質量濃度的138倍。

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